[发明专利]一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用

说明书

一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用，利用Boyden小室分离肝癌转移细胞的突出与胞体，从亚细胞结构出发，运用改良的Boyden小室法分离肝癌转移细胞胞体和突出，利用Western‑blot、RNA染色、免疫荧光等技术验证分离结果。研究在HCCLM3肝癌细胞胞体与突出中差异表达的情况、筛选出与HCC浸润转移过程有关的微小RNA，在临床上实验证明个体血清hsa‑let‑7c‑3p的变化对于HCC的诊断有较高的灵敏度及特异性。本发明将为临床诊断原发性肝癌提供一种新的诊断手段，在辅助HCC的治疗以及病程监测上有一定的潜在临床价值，通过let‑7c‑3p的ROC曲线，以及let‑7c‑3p与CEA联用、let‑7c‑3p与AFP联用、let‑7c‑3p与AFP和CEA联用的ROC曲线，提高了灵敏度及特异性，诊断价值得到了明显的提高。

技术领域

本发明具体涉及分子生物技术领域，具体涉及一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用。

背景技术

肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范围内的第五种最常见的恶性肿瘤。尽管这些年在HCC的诊疗上有很大的进步，但由于临床上HCC经常会有复发和转移，HCC患者的5年生存率仍然相当低。HCC的发生和发展是一个典型的多阶段过程：首先是肝脏组织在外界刺激下（B型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染、黄曲霉毒素B1的摄入量或酒精滥用等）发生慢性肝炎或肝硬化，然后在经历一系列增生和不典型增生阶段后，最终获得肝内转移和远端转移的恶性表型。

肿瘤的浸润转移是指肿瘤细胞脱离其原发部位，向其它部位传播，进而浸润正常组织，并经过淋巴道、血管或体腔及其它方式，转运到继发的靶组织或器官，从而继续增殖生长，形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的过程。细胞开始形成局部浸润和远处转移能力是恶性肝肿瘤早期特有的性质，因此研究肝肿瘤细胞浸润和转移初期机制对临床诊疗有十分重要的意义。而肝癌的进展涉及到很多调控细胞周期调控、细胞生长、细胞凋亡、细胞迁移的关键基因（见图2）。

近年来在HCC的基础与临床研究方面虽然取得了一些进展，但始终未能阐明HCC转移复发的机制。因此，寻找有效的转移复发抑制途径，已成为进一步提高生存率的关键。研究提示，在人类肿瘤中，microRNA（miRNAs）既可以作为癌基因促进肿瘤的发生和发展，也可以发挥抑癌基因的功能抑制肿瘤。

寻找肿瘤相关的miRNAs，并探讨其具体作用的机制或其成为新的分子诊断标志物，已成为肿瘤相关研究中的新方向。miRNAs的异常表达参与肿瘤的发生和发展，在肿瘤产生、癌细胞增殖和调亡、肿瘤的血管发生、侵袭和转移等方面发挥着重要的作用。相应的研究亦证实：某些miRNAs在HCC的肿瘤产生、肿瘤细胞增殖和凋亡、肿瘤的血管发生、侵袭和转移等方面发挥着重要的作用。研究发现miRNAs在肝癌组织中经常表达失调，并且一些特定的miRNAs与肝癌的转移、复发和预后等临床病理特征相关。因此，miRNA可能作为HCC新的分子诊断标志物和治疗靶点。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的提供了一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物及筛选方法与应用。

一种改良的肝癌转移细胞胞体和突出的分离方法。

本发明采用的技术解决方案是：一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物，所述的特异性生物标志物为miRNA hsa-let-7c-3p。

一种用于诊断原发性肝癌的血清特异性生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)建立HCCLM3细胞模型

(2)从已建成的细胞模型中分离细胞突出和细胞体；

(3) 从分离的细胞突出和细胞体中分别提取 RNA；

(4)在前期miR-SEQ测序结果内筛选本体表达高且差异倍数大的候选miRNAs；