[发明专利]一种分离纯化他克莫司的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种分离纯化他克莫司的方法。

背景技术

他克莫司又名FK-506(Tacrolimus)，是由日本藤泽制药公司于1982年从筑波链霉菌代谢产物中提取的一种大环内酯类免疫抑制剂。本品对T细胞具有选择性的抑制作用，主要是通过抑制TH细胞释放IL-2、IL-3、IFN-γ，以及抑制IL-2R的表达而发挥其强大的免疫抑制作用。适用于防治器官移植后的排斥反应，其临床疗效是环胞素的100倍。

目前，他克莫司主要通过发酵法进行制备，因此在发酵过程中会产生诸多异构体或者类似物，采用传统的反相树脂、改性硅胶进行分离纯化的技术方案所最终纯化得到的他克莫司的纯度并不理想，通常只能达到98％左右。纯化后的他克莫司中仍然存在诸多异构体等杂质，从而对由他克莫司所制成的免疫制剂的药效造成一定的影响，并可能对患者造成较大的副作用。

有鉴于此，有必要对现有技术中的他克莫司进行分离并纯化的技术方案予以改进，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于揭示一种分离纯化他克莫司的方法，用以实现对发酵法制备他克莫司所形成的含有他克莫司的发酵液中直接进行纯化操作，以制备高纯度的他克莫司，以提高由他克莫司所制成的免疫制剂的药效。

为实现上述目的，本发明提供了一种分离纯化他克莫司的方法，包括以下步骤：

(1)制备低色谱纯度他克莫司发酵提取液，使用0.45微米的微孔有机滤膜抽滤后，待用；

(2)在第一套中压层析色谱设备中使用层析硅胶作为填料，使用丙酮和/或乙醇进行清洗和平衡；

(3)将低色谱纯度他克莫司发酵提取液在第一套中压层析色谱设备中层析，使用有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液旋转蒸发，用有机溶剂溶解后再次使用0.45微米的微孔有机滤膜抽滤；

(4)在第二套中压层析色谱设备中使用反向硅胶作为填料，待用；

(5)使用至少含丙酮的有机溶剂清洗反向硅胶，并将步骤(3)中所得样液配置为适宜上样的溶液，上样后经过多段洗脱，得到洗脱液；

(6)将步骤(5)中所得洗脱液多批合并，使用纳滤膜浓缩，并进行脱色处理；

(7)将步骤(6)中所得浓缩液进行结晶，并烘干。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(1)中他克莫司发酵提取液的色谱纯度为60％。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(2)中的层析硅胶的粒径为300～400目，压力条件为60psi～90psi。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(3)中的旋转蒸发的蒸发温度为35℃温度，转速为70rpm，真空度为-0.09MPa～-0.1MPa。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(6)中所选用的纳滤膜的分子量为200，浓缩条件为：温度20℃～60℃、压力0.8MPa～1.2MPa。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(7)中，结晶前的浓缩液应满足以下条件：

浓度为75g/L～80g/L、PH9.30～9.60。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(7)中的结晶具体为：使用纯蒸汽加热步骤(6)中所得的浓缩液至35℃～55℃，随后立即使用0.45微米的微孔有机滤膜抽滤，并用0℃～70℃的丙酮淋洗，以进行结晶。

作为本发明的进一步改进，所述步骤(7)中的烘干具体为：结晶后的他克莫司晶体置于真空烘箱中进行干燥，所述真空烘箱中的烘干温度设定为30℃～40℃，真空烘箱的真空度为-0.098MPa～-0.102MPa。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过本发明所揭示的一种分离纯化他克莫司的方法，可实现从含有他克莫司的发酵液中直接进行纯化操作，并显著地提高了他克莫司的纯度，间接地提高了由他克莫司所制成的免疫制剂的药效。

附图说明

图1为实施例1所最终制得的他克莫司的HPLC图谱；

图2为实施例2所最终制得的他克莫司的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合附图所示的各实施方式对本发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。

实施例1：

本实施例所示出的一种分离纯化他克莫司的方法，包括以下步骤：