[发明专利]一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记与应用。

背景技术

镉( Cd)、砷( As) 、铬( Cr) 和汞( Hg) 等是公认的对植物和人体危害比较大的重金属元素，其中镉对人体的伤害最大。烟草（Nicotiana tabacum）是重要的经济作物，是茄科一年生草本植物，而且烟草是富镉作物，其对镉的富集系数达到10，所以近年来关于降低烟草中的镉含量也逐渐成为烟草减害研究的一个热点。

镉对人体的危害巨大，过量的镉进入人体内可能对血管造成损害；另外镉元素对肠道吸收铁具有抑制作用，还会干扰钴、铜、锌等微量元素的代谢过程，引起肺、肾、肝等人体脏器损害，最终可能导致致癌、致畸和致突变等作用。

拟南芥中AtHMA2、AtHMA4主要负责锌和镉从根部向地上部的转运。NtHMA2基因突变或干涉后可以降低地上部镉的镉含量（Hermand等，2014，Metallomics，6（8）：1427-1440）。为了降低烟草镉含量，利用EMS诱导我国大面积种植烟草品种云烟87，并从中筛选到一个NtHMA2基因终止突变体，命名为hma2-2h23。镉其镉含量可以降低到野生型的60%左右。突变体hma2-2h23可以应用于烟草育种培育低镉含量的烟草品种。开发一种简单、方便、有效的区分突变体与野生型品种的分子标记，以实现对突变型的精准鉴定，对后续利用突变位点进行育种筛选具有重要价值。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记；第二目的在于提供所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，与NtHMA2野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.1所示；与NtHMA2突变体位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.2所示。

本发的第二目的是这样实现的，所述的鉴别烟草镉转运基因NtHMA2野生型和突变体的分子标记在利用突变体hma-2h23改良烟草低镉特性回交转育过程中的应用。

本发明与现有的技术具有如下优点和效果：

（1）开发了一种用于区分烟草镉转运基因NtHMA2突变体与野生型的分子标记，包括两对PCR扩增引物（第一轮PCR引物HMA2-F/HMA2-R，第二轮PCR引物HMA2-2H23-DC1F /HMA2-2H23-DC1R）和一个限制性内切酶BsmFI。

（2）本发明的功能性标记通过常规PCR扩增和酶切反应，能够特异性地检测NtHMA2基因突变后的低镉突变体hma2-2h23，而不需要通过测序检测突变等位基因。本标记更加简单、快捷。该标记可以应用于利低镉突变体hma2-2h23培育低镉烟草材料的过程中，尤其是回交改良低镉特性时，每个回交世代都要选择杂合基因型，该标记可以准确选择目标基因型（杂合型）与轮回亲本回交。

附图说明

图1为烟草镉转运基因NtHMA2野生型序列与突变体hma2-2h23序列比对结果；

图2为第一轮PCR上游引物（HMA2-F）和下游引物（HMA2-R）扩增产物电泳图，其中M为100bp DNA Ladder，1-7为突变位点杂合材料， 8-12为野生型材料， 13-15为突变位点突变纯合材料；

图3为第二轮PCR上游引物（HMA2-2H23-DC1F）和下游引物（HMA2-2H23-DC1R）扩增产物电泳图，其中M为100bp DNA Ladder，1-7为突变位点杂合材料， 8-12为野生型材料， 13-15为突变位点突变纯合材料；

图4为第二轮PCR产物经BsmFI酶切后电泳图，其中M为100bp DNA Ladder，1-7为突变位点杂合材料， 8-12为野生型材料， 13-15为突变位点突变纯合材料；

图5 为样品测序结果，方框所示为突变碱基位点，上为样品1：突变位点为碱基T和C混合，显示双峰，杂合突变；中为样品8：突变位点为碱基C，显示单峰，野生型纯合；下为样品13：突变位点为碱基T，显示单峰，突变体纯合。

具体实施方式