[发明专利]一种头孢菌素C酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用

说明书

本发明公开了一种头孢菌素C酰化酶突变体及其在7‑氨基头孢烷酸生产中的应用，属于酶制备技术领域，包括如下步骤：通过引物A获取基因序列、重组表达蛋白、检测酶活和制备7‑氨基头孢烷酸。本发明通过定向进化得到酶活性增强的头孢菌素C酰化酶突变体，酶活性比野生性头孢菌素C酰化酶提高5倍以上，三小时底物转化率达95％‑98％，副产物D‑7ACA小于0.8％，优于行业内标准，通过使用本蛋白突变体，能有效地制造半合成头孢菌素类药物的重要中间体，工艺简单且得率高，技术可移植性强，只要一般的发酵车间即可投入生产，不需购置特殊设备，易于推广应用，本发明具有较强的实用性和推广价值。

技术领域

本发明涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体及其应用，特别是涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体制备方法，属于酶制备技术领域。

背景技术

目前，7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是医药工业生产半合成头孢菌素类药物的重要中间体，国内外在工业上多采用化学法由头孢菌素C钠(锌)盐脱去其侧链来生产，但化学法存在工艺复杂、成本高等问题，而且还会严重污染环境；与化学法相比，酶法裂解可以使生产过程大大简化，例如：发酵得到的头孢菌素C不需结晶就可用于酶解，生产过程中没有用到有毒溶剂，可省掉加保护剂和去保护剂等步骤，产品能够达到高收率、高质量，同时降低成本和减少污染。因此近年来人们着力进行酶法生产7-ACA的研究。

目前，人们研究较多的是两步酶法制备7-ACA，首先，头孢菌素C在通氧气情况下被D-氨基酸氧化酶(DAAO)催化，产生具有酮基的中间体(keto-7-ACA)和H₂O₂，这个中间体较不稳定，很容易被同时产生的H₂O₂化学氧化脱羧，转变成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)，然后GL-7-ACA在GL-7-ACA酰化酶的作用下脱去其侧链，生成7-ACA。

目前，国内7-ACA大部分的生产厂家已将7-ACA的生产线由化学法转换为酶法，7-ACA D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶国内也有厂家大批量生产。虽然，两步酶法制备7-ACA在生产成本和环境保护方面有优势，但是从头孢菌素C到7-ACA的转化率与化学法相比要低，而且DAAO催化反应难以控制，头孢菌素C酰基转移酶(CPC acylase)可以直接把头孢菌素C转变到7-ACA(不经过GL-7-ACA等中间产物，因此其转化率与化学法相当，而且能得到较高质量的7-ACA。

目前，利用CPC acylase生产7-ACA的一步酶法是全新的7-ACA酶法工程，既具有高转化率和纯度，也具有高经济性和环境保护的优势，具有生产工艺简单、设备要求低及生产成本低等优点。但是天然存在的头孢菌素C酰化酶对头孢菌素C的催化活性低，仅为GL-7-ACA酰化酶的2-4％，难以实现产业化，故亟需开发出高酶活的头孢菌素C酰化酶突变体用于产业化生产。

国内企业对于头孢菌素C酰化酶生产7-ACA工艺的提升上主要包括以下几个方面：通过定点突变以提高头孢菌素C酰化酶的活性；对大肠杆菌进行基因敲除，从而消除分解底物的蛋白表达，用以提高7-ACA的产率和纯度；头孢菌素C酰化酶的固定化研究，以缩减生产成本等。前述这些方法虽然使得酶活力在一定程度上有所提高，但是仍然无法满足工业需求，同时得到的突变型头孢菌素C酰化酶容易受7-ACA产物的抑制，使7-ACA的产率低，转化速率低，酶的活性受外界影响较大。

发明内容

本发明的主要目的是为了提供一种头孢菌素C酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用，通过定向进化得到酶活增强的头孢菌素C酰化酶突变体，提高酶活性，增强底物转化率，降低副产物生成率。

本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：

一种头孢菌素C酰化酶突变体，能够催化头孢菌素C生成7-氨基头孢烷酸，所述头孢菌素C酰化酶突变体与野生型头孢菌素C酰化酶相比表现出更高的催化活性，酶活提高约8.6倍。

进一步的，头孢菌素C酰化酶突变体选自序列SEQ ID NO.1。