[发明专利]一种分离鉴别大丽轮枝菌的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种分离鉴别大丽轮枝菌的方法。

背景技术：

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae.Kleb.)是世界性的土传植物病原真菌，属于子囊菌亚门(Ascomycota)、子囊菌纲(Sordariomycetes)、轮枝菌属(Verticillium)，广泛分布在温带和亚热带地区，可危害200多种双子叶植物，导致棉花、茄子、草莓、番茄、马铃薯等多种重要的经济作物和园艺作物发生黄萎病，造成重大经济损失。据统计，在全球范围内每年导致的农业经济损失就达到数十亿美元。在国内，仅从棉花的统计数据来看，由大丽轮枝菌引起的黄萎病数次大规模爆发，造成极大的危害。由于大丽轮枝菌变异频繁，导致致病机理复杂、抗病育种滞后、抗病品种抗性丧失过快，难以有效防止黄萎病的暴发。因此，有效的识别鉴定病原菌，对于抗病育种和病害的综合防治具有重要意义。

在大丽轮枝菌的众多寄主作物中，仅仅番茄和莴苣这2种作物表现出对大丽轮枝菌的小种特异性抗性，因此，目前只有危害番茄和莴苣的大丽轮枝菌被划分为2个生理小种，race 1和race 2。而危害其他作物的大丽轮枝菌则无法划分为生理小种，只能称之为生理型。大丽轮枝菌致病力变异性强，在与寄主协同进化的过程中，常出现生理分化，产生新的生理型。对于大丽轮枝菌生理型的主要鉴定方法有鉴别寄主鉴定、培养性状鉴定、营养亲和性鉴定、同工酶技术鉴定、免疫技术鉴定、分子标记技术鉴定等，其中通过鉴别寄主鉴定可将大丽轮枝菌划分为强、中、弱3个生理型；通过培养性状鉴定一般多被用来研究病原菌形态方面的变异，方法简单而且直观，可将大丽轮枝菌分为菌丝型、菌核型和中间型；通过分子技术标记鉴定，用特异性引物D-1/D-2、ND-1/ND-2可将落叶型和非落叶型菌株区分开。

大丽轮枝菌在PDA平板上的培养性状差异明显，已有研究表明棉花黄萎菌株中以来源自长江流域的培养性状变异最大。按照各单孢菌株在PDA培养基上培养第14d时产生黑色微菌核的多少，将供试菌株分为菌核型(VH)、菌丝型(VS)和中间型(VM)3种类型。菌核型产生大量黑色微菌核，菌落正面或反面至少有一面呈现完全黑色，典型的正面和反面都为完全黑色，有的表面有辐射状条纹；有的正面完全为黑色，但反面中心圈为白色；有的反面完全为黑色，但正面中心圈覆盖白色气生菌丝。菌丝型不产生黑色微菌核，菌落正反面完全呈白色或浅黄色，有的表面有辐射状条纹，有的正面完全覆盖白色气生菌丝或者仅中心圈覆盖白色气生菌丝。中间型仅产生少量微菌核，介于菌核型和菌丝型之间，菌落正面和反面夹杂有一圈黑色，表现为有的中心圈为白色，覆盖白色气生菌丝，而周圈为黑色；有的中心圈为白色，中圈为黑色，有辐射状条纹，而周圈为白色；有的中心圈为黑色，覆盖白色气生菌丝或者有辐射状条纹，而周圈为白色。

正是由于大丽轮枝菌在PDA培养基上的菌落特征变异很大，因此，在病原菌的分离工作中往往会将其它真菌误判为大丽轮枝菌。由于在大丽轮枝菌致病性研究中，往往分离获得的菌株较多，不可能对所有分离到的菌株都进行病原菌的鉴定。本发明实现了快捷地从众多分离物中识别非大丽轮枝菌，对于黄萎病的抗病育种和综合防治具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的在于：针对目前黄萎病菌分离鉴定中存在的实际问题，提供一种识别非大丽轮枝菌的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种分离鉴别大丽轮枝菌的方法，其特征在于：

a、病样的采集：在黄萎病地中，选择症状典型的重病株；剪取植株的一段主干，去除侧枝；装于纸质信封中或者用纸包好；在信封或报纸上写明采集地点，采集品种，采集人和采集时间；对病样进行编号，室温晾干，4℃保存；