[发明专利]犬细小病毒抗体快速定量检测卡及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测卡及使用，特别是涉及一种犬细小病毒抗体快速定量检测卡及使用方法。

背景技术

犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）是一种主要感染犬的传染性病毒。该病传染性强。犬之间通过对于其粪便的直接或间接接触而传播该病。犬细小病毒为无囊膜，单负股的DNA病毒，由3个结构蛋白VP1、VP2和VP3组成。其中 VP2 是其保护性颗粒抗原。有研究结果表明 VP2 可诱导犬产生中和抗体，并能保护犬抵御强毒的攻击。该病毒粒子很小，直径 20～22 nm，呈二十面体对称。CPV 属于细小病毒科细小病毒属成员。犬细小病毒病与猫泛白细胞减少症有密切的抗原组分关系。

犬细小病毒病又称为犬传染性肠炎、犬细小病毒性肠炎或出血性肠炎，是20世纪70年代末发现的一种由犬细小病毒引起的出血性肠道传染病。是犬危害极大疫病之一。该病以剧烈呕吐、腹泻、白细胞显著减少和病死率较高为主要临床特征，可以侵害各种年龄的犬，其中以幼犬发病率最高，常为60～100%，死亡率达70%，若不经治疗则病犬的成活率小于5%。

犬细小病毒的防控主要是疫苗免疫，而疫苗免疫动物与感染动物体内都会产生结构蛋白抗体，因此检测结构蛋白抗体的诊断方法能确定动物对病毒株的抵抗力。同时日常监测疫苗产生抗体是对群体的日常监测选择疫苗、评估免疫程序合理性、掌握猪群健康状态的重要手段，同时也可从侧面反映管理是否合理，也是适时注射疫苗的主要依据。

市场上大量使用检测犬细小病毒抗体酶标试剂盒，ELISA试剂盒需要酶标仪、温育反应条件、洗板条件，操作工作环境和专业技术人员，另外检测样本还需要复杂的前处理，如采集血液，分离血清等；而快速胶体金虽然检测方便，不需专业技术人员和工作环境，但其检测的灵敏度低，且只能定性，检测范围窄。而本发明专利的目的就是克服以上两类试剂盒的各自缺点，通过简单的操作，现场快速、准确、高灵敏地定量（半定量）分析，实现在养猪现场检测。

发明内容

本发明的目的就是提供一种犬细小病毒抗体快速定量检测卡及使用方法，克服胶体金快速检测卡和酶标试剂盒各自缺点，通过简单的操作，实现在现场快速、准确、高灵敏地定量检测，从而完全解决上述现有技术的不足之处。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种犬细小病毒抗体快速定量检测卡，包括检测卡外壳和装配在检测卡外壳内的试纸条，所述试纸条包括带压敏胶的塑料底板，在底板上依次粘贴样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述标记物垫由载体基层和标记物组成，标记物为载体基层上喷涂镧系荧光检测微球和镧系荧光质控微球形成的一层膜，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上包被犬细小病毒重组抗原为检测线，包被兔抗鸡lgY抗体为质控线，标记物为标记有犬细小病毒结构蛋白VP2的重组抗原的荧光检测微球和标记鸡lgY抗体的荧光质控微球。

进一步，所述犬细小病毒重组抗原是犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白，其为多表位表达的重组蛋白。

进一步，所述硝酸纤维素膜上质控线采用的兔抗鸡lgY抗体为兔抗鸡lgY的lgG。采用生物信息学技术（Bioinformatics）对犬细小病毒不同亚型毒株的VP2基因进行比对，确认犬细小病毒VP2蛋白基因序列，设计一对引物，经PCR扩增出目的VP2基因，将VP2基因连接到真核表达载体pEGFP-C1上，构建出重组质粒pEGFP-VP2。之后进行双酶切鉴定。利用 Lipofecta mine 2000 （脂质体2000转染试剂）转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中，通过 G418 筛选后，在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光，这表明重组融合蛋白 pEGFP-VP2在 PK-15 细胞中得到了表达。将能够表达重组融合蛋白的细胞进行克隆，以便进一步大量表达和纯化制备犬细小病毒结构蛋白VP2蛋白。

一种制备上述犬细小病毒结构蛋白的方法，采用生物信息学技术原理，应用计算机对犬细小病毒的结构蛋白VP2抗原基因进行比对分析，及抗原表位预测，筛选和设计犬细小病毒结构蛋白特异性的抗原肽序列，并进行人工化学合成抗原肽。