[发明专利]热稳定性提升的角蛋白酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了热稳定性提升的角蛋白酶突变体及其应用，属于工业生物技术领域。将来源于Brevibacillus parabrevis CGMCC No.10798的角蛋白酶第181位天冬酰胺、第218位酪氨酸、第236位丝氨酸进行定点突变改造，并对上述位点进行随机组合制备获得组合突变体。本发明实现了角蛋白酶热稳定性的1～4.09倍的显著提高，具有良好的理论价值和应用前景。

技术领域

本发明涉及热稳定性提升的角蛋白酶突变体及其应用，属于工业生物技术领域。

背景技术

角蛋白是一类难降解的不溶性蛋白质，广泛存在于自然界，是继纤维素和壳聚糖之后的第三大类聚合物。在脊椎动物的皮肤、毛发、羽毛、角、指甲、喙及鱼的牙齿和粘液中含量丰富，作为一种结构蛋白，对动物体起保护作用，以使其能够应对自然界环境和其他生物的干扰。由于角蛋白富含二硫键、氢键和分子间疏水相互作用力，所以其结构致密、性质稳定，对许多化学品的作用不敏感，也难以被普通蛋白酶类降解。

角蛋白酶可以将不溶性角蛋白特异性降解为可溶性蛋白或者多肽。由于具备独特的底物特异性，角蛋白酶在制革、洗涤、角蛋白废弃物降解和饲料加工等领域中表现出良好的应用前景。

本发明的亲本酶副短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis CGMCC No.10798生产的角蛋白酶在较高温度下热稳定性较差，在60℃保温30min后，残余酶活仅为38％，限制了该酶在工业生产中的产品开发和推广，尤其在洗涤、角蛋白废弃物降解和饲料加工等领域的应用过程中通常需要涉及到较高温操作、酶容易失活。为进一步提高该角蛋白酶在工业生产中的应用潜力，提高该酶的稳定性，从而节约成本、提升应用效率将成为角蛋白酶研究的重要方向。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种角蛋白酶的突变体，所述突变体以副短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis CGMCC No.10798角蛋白酶为亲本蛋白酶，是将亲本角蛋白酶的第181位的天冬酰胺、第218位酪氨酸、第236位丝氨酸中的至少一处突变为其他氨基酸。

在本发明的一种实施方式中，是将第181位的天冬酰胺突变为天冬氨酸。

在本发明的一种实施方式中，是将第218位酪氨酸突变为丝氨酸。

在本发明的一种实施方式中，是将第236位的丝氨酸突变为半胱氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述亲本蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1～3中的任一种。

本发明的第二个目的是提供编码所述蛋白酶突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pMD系列、pET系列中任意一种。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为载体pET22b(+)。

本发明的第四个目的是提供表达所述角蛋白酶突变体的细胞系。

在本发明的一种实施方式中，宿主细胞可选自大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、棒杆菌(Corynebacterium)、酵母、丝状真菌(Filamentous fungi)中的任意一种。

本发明的第五个目的是提供一种提高角蛋白酶热稳定性的突变体的方法，包括以下步骤：