[发明专利]用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法

权利要求书

1.用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)抽提样品的基因组DNA；

(b)提供扩增人LINC00520基因多态性rs8012083位点附近序列的正向引物和反向引物，以步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；

(c)使用限制性内切酶对(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；

(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC00520基因多态性rs8012083的各基因型。

2.根据权利要求1所述的用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，其特征在于，步骤(b)中所述正向引物和反向引物的设计与合成具体为：碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，确定LINC00520多态位点碱基变异数据；含LINC00520rs8012083的部分基因序列如SEQ:ID:NO:1所示；基因序列的第507个碱基R代表了A/G多态，即为rs8012083的多态性位点；根据rs8012083的具体序列和多态性碱基的位置采用Primer Premier 6.0设计，设置引物长度和扩增目的片段长度的参数进行引物设计，根据GC含量和退火温度选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能进行引物比对，最终确定的上下游引物，正向引物序列如SEQ:ID:NO:2所示；反向引物序列如SEQ:ID:NO:3所示，其中反向引物序列中倒数第2位碱基为T(扩增产物的对应位置为错配碱基A)，因此错配后PCR产物中多态附近序列由GTTACT或ATTACT更改为GTTAAT或ATTAAT；因此扩增产物中A等位基因片段能被识别ATTAAT序列的限制性内切酶识别；进而，根据片段切开情况来判断多态基因型；

按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成采用固相合成法，或者委托生物公司合成并检测正向和反向引物。

3.根据权利要求1所述的用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，其特征在于，步骤(b)中PCR扩增反应中制备PCR扩增体系具体为：2×Taq PCR Mix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μlPCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括35个循环三个步骤，首先94℃变性30s，54℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为157bp的PCR扩增产物；扩增后的产物序列如SEQ:ID:NO:4所示。

4.根据权利要求1所述的用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，其特征在于，步骤(c)中进行酶切的酶切体系具体为：PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中37℃酶切1-16h，即得酶切产物；综合考虑经济实用性以及简单操作性最终选择VspI进行酶切鉴定。

5.根据权利要求1所述的用VspI检测人胃癌LINC00520基因rs8012083多态性的方法，其特征在于，步骤(d)琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性具体为：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4-10V/cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定；对于不同的基因型，rs8012083位点不同基因型展现出不同的条带，野生基因型AA，长为138bp，19bp两条带；杂合基因型AG，长为157bp，138bp及19bp三条带；杂合基因型GG，157bp一条带。