[发明专利]用于检测EGFR基因2312-2313位突变的引物、探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测EGFR基因2312‑2313位突变的引物、探针及试剂盒。所述引物如SEQ ID No.1‑SEQ ID No.2所示，所述探针如SEQ ID No.3所示。利用本发明的试剂盒进行实时荧光PCR，可以检测EGFR基因2312‑2313位插入ACCCCA碱基突变。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种用于检测EGFR基因突变的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

恶性肿瘤在中国发病率近年来呈逐年上升趋势，每年新增患者达170万人以上。肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其中80％～85％为非小细胞肺癌(nonsmall celllungcancer，NSCLC)。在我国，肺癌已成为恶性肿瘤第一位死因，5年生存率约15％。随着肿瘤分子生物学的发展，靶向治疗倍受关注，选择合适的患者进行靶向治疗是其成功的关键，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是目前肿瘤治疗的重要靶点。

EGFR基因位于人第7号染色体短臂(7p12)，长约118kb，由28个外显子组成。其转录形成的mRNA长约5.6kb，编码分子量为170kD的跨细胞膜糖蛋白，胞内区具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)活性，负责将胞外信号传递至胞内。异常的EGFR活化能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移、分化、血管新生，并且能够抑制肿瘤细胞的凋亡。

EGFR基因突变主要发生在胞内TK区域的前4个外显子上(18～21外显子)，研究表明：EGFR基因18、19、21外显子发生突变的肺癌患者服用酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinase inhibitors，TKIs)类药物的疗效较好，20外显子发生的突变常与TKIs耐药有关^[1-4]。中国肺癌患者中，EGFR的突变率约为30％～50％，其中18外显子上发生的点突变约占EGFR突变类型的5％左右，19外显子上发生的多种缺失突变约占EGFR突变类型的45％左右，21外显子上发生的L858R、L861Q点突变约占EGFR突变类型的40％～45％，20外显子上发生的T790M点突变约占EGFR突变类型的5％左右[5-6]。

目前Sanger测序法是EGFR基因突变检测的主要方法。然而，该方法的灵敏度低，会导致漏检及假阴性的发生，而且检测时间长，无法满足临床检测的实际需求。临床上迫切需要开发一种高灵敏度、快速的EGFR基因突变检测技术。

本发明的发明人在胃肠道间质瘤(GIST)的日常检测中发现了与胃肠道间质瘤有关的位于EGFR基因的新突变位点，即2312-2313位插入突变。本发明的发明人针对该突变开发了一种快速、高灵敏、操作简便的检测试剂盒及相关的检测方法，可以用于GIST化疗预后。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于检测EGFR基因突变的引物和探针，所述突变是2312-2313位插入ACCCCA(碱基突变：2312-2313insACCCCA，蛋白突变：N771＞KPH)。本发明的引物与探针包括如下序列：

正向引物(F)：GACAAACCCC ACCCCCA(SEQ ID No：1)

反向引物(R)：GGACATAGTC CAGGAGGCA(SEQ ID No：2)

探针(PB)：TGGGCATCTG CCTCACCTCC A(SEQ ID No：3)

本发明另一方面提供一种用于检测EGFR基因2312-2313位突变的检测试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.2所示的引物和SEQ ID No.3所示的探针。

根据所采用的PCR方法，本发明的试剂盒还可以包括内参基因和内控基因。

本发明另一方面提供一种获得与EGFR基因2312-2313位突变有关的Ct值的方法，其包括以下步骤：