[发明专利]一种大黄鱼的抗氧化反应指示物

权利要求书

1.一种大黄鱼的抗氧化反应指示物的用途，其特征在于：所述大黄鱼的抗氧化反应指示物用于考察海水中的重金属污染情况的用途。

2.一种大黄鱼的抗氧化反应指示物的确定方法，其特征在于：具有如下步骤：

驯化大黄鱼：将大黄鱼圈养15-20天，每天2-3次投喂商业饲料，选取135条尺寸均一、重量为86-92g的大黄鱼随机分配到9个玻璃缸中，将HgCl₂加入到养殖水缸中配成含Hg溶液，含量分别为32、64μg Hg L^-1，分别取暴露于Hg环境6、12、24、48、96小时后的大黄鱼，过量麻醉致死后取肝脏样本待用；

提取肝脏物质：将肝脏样本均质到10-15倍的冰冷的缓冲液中，肝脏匀浆经首次离心以沉淀大分子，经再次离心收集漂浮物保存以供生化分析；

RT-PCR实时荧光定量检测：依据TRIzol（Invitrogen）试剂盒说明进行肝脏总RNA的提取，用2-3mg总RNA作为模板，按照first-strand cDNA synthesis kit(Fermentas)说明书合成第一链cDNA，cDNA稀释入200μL蒸馏水中；RT-PCR放大反应体系为20μL，包含10μLSYBR Premix Ex Taq Master Mix (Takara)、1.98-2.03μLcDNA、0.19-0.21μM上游引物、0.19-0.21μM下游引物。

3.根据权利要求2所述的一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，其特征在于：所述的大黄鱼驯化步骤中饲料中的脂质与蛋白质的干物含量分别为10-11%与48-50%。

4.根据权利要求2所述的一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，其特征在于：所述的大黄鱼驯化步骤中的水质参数为：水温20-28℃，盐度25.5-26.5、溶氧量6.8-7.2mg/L，pH值为7.52-8.04，水质硬度为碳酸钙浓度120-125mg/L，每天更换水体，持续自然光照。

5.根据权利要求2所述的一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，其特征在于：所述的提取肝脏物质步骤中的缓冲液组成为：1.0-1.2mMEDTA、1.0-1.2mMDTT、0.5-0.6M蔗糖溶液、0.15-0.18MKCl、0.13-0.15μM（S）-4-苄基-2-唑烷酮，pH为7.6-7.8。

6.根据权利要求2所述的一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，其特征在于：所述的提取肝脏物质步骤中的首次离心的参数为：0-4℃、900-1000g离心8-10分钟，再次离心的参数为：0-4℃、12000-14000g离心15-20分钟。

7.根据权利要求2所述的一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，其特征在于：所述的提取肝脏物质步骤中将收集的漂浮物保存于-80~-100℃温度下。

8.根据权利要求2所述的一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，其特征在于：所述的RT-PCR实时荧光定量检测步骤中，大黄鱼Nrf2基因引物序列为：

F：CCCTCAAAATCCCTTTCACT，R：GCTACCTTGTTCTTGCCGC；内参基因β-Actin引物序列为：F：TCGTCGGTCGTCCCAGGCAT，R：ATGGCGTGGGGCAGAGCGT。

9.根据权利要求2所述的一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，其特征在于：所述的RT-PCR实时荧光定量检测步骤中，PCR反应的程序设定为：94-95℃1分钟，其次是93-95℃5秒、55-57℃10秒、70-72℃30秒一个循环周期，循环运行45-48个周期。