[发明专利]一种诱导人脊髓运动神经前体细胞分化为脊髓运动神经元的方法

说明书

本发明公开一种诱导人脊髓运动神经前体细胞分化为脊髓运动神经元的方法，包括以下步骤：1)脊髓运动神经前体细胞的培养：将脊髓运动神经前体细胞消化成单细胞，接种至包被好的培养皿中进行贴壁培养，培养液为脊髓运动神经前体细胞培养基，37℃5％CO₂饱和湿度培养箱培养；2)脊髓运动神经元的诱导：在基础完全培养基中培养步骤1)获得的脊髓运动神经前体细胞，在不同时间添加不同的时空特异性信号通路调控小分子和/或生长因子诱导分化，37℃5％CO₂饱和湿度培养箱培养3‑30天，每两天换液一次，即可。本发明方法高效快速、稳定安全，在分化第三天就可以获得70％以上脊髓运动神经元。

技术领域

本发明涉及细胞分化培养技术领域。更具体地，涉及一种诱导人脊髓运动神经前体细胞分化为脊髓运动神经元的方法。

背景技术

近些年，由于车祸、摔伤、挫伤等原因造成的脊髓损伤病人数量呈逐年上升的趋势。由于脊髓内部神经受损，脊髓损伤病人一般下肢瘫痪，生活难以自理。在正常的生理状态下，人体内损伤的神经细胞无法自我修复，所以传统的医疗手段很难彻底治愈该疾病。细胞替代性治疗为脊髓损伤患者提供了一种新的治疗途径。脊髓运动神经元是用于脊髓损伤的疾病治疗的理想细胞类型之一。除此之外，脊髓运动神经元在新药筛选，新药毒性测试等方面也发挥着重要作用。

神经元细胞不具备增殖能力，体内分离后无法在体外扩增。而在合适的条件下，神经前体细胞可以在体外扩增，并具有分化为神经元的潜能。传统的将神经前体细胞分化为神经元普遍存在分化时间长、分化效率低的问题。而且，在分化的过程中都会涉及到动物源性成分和提取蛋白的使用，动物源性成分会有潜在引入病原微生物的风险，提取蛋白批次之间均一性难以控制，会导致分化体系不稳定。在传统的脊髓运动神经前体细胞分化为脊髓运动神经元的过程中，同样存在着上述问题，分化时间至少需要七天，分化效率只有不到40％。

因此，需要提供一种诱导人脊髓运动神经前体细胞分化为脊髓运动神经元的方法，使得临床应用的脊髓运动神经元具有(1)细胞获得方便；(2)细胞纯度高；(3)细胞培养液成分简单，不含有动物源性成分等特点，保证临床应用细胞的安全性、有效性和可追溯性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效快速、稳定安全的诱导人多能性干细胞分化为脊髓运动神经前体细胞的方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提供了一种诱导人脊髓运动神经前体细胞分化为脊髓运动神经元的方法，包括以下步骤：

1)脊髓运动神经前体细胞的培养：将脊髓运动神经前体细胞消化成单细胞，接种至包被好的培养皿中进行贴壁培养，培养液为脊髓运动神经前体细胞培养基，37℃5％CO₂饱和湿度培养箱培养；

2)脊髓运动神经元的诱导：在基础完全培养基接种步骤1)获得的脊髓运动神经前体细胞，在不同时间添加不同的时空特异性信号通路调控小分子和/或生长因子诱导分化，37℃5％CO₂饱和湿度培养箱培养3-30天，每两天换液一次，即可。

本发明中步骤1)所述人脊髓运动神经前体细胞，来源可以是体内分离培养获得的，诱导人多能性干细胞分化获得的、体细胞转分化获得的等；优选，体内分离培养或者诱导人多能性干细胞分化获得的，最优选，诱导人多能性干细胞分化获得的。

进一步，所述包被好的培养皿是多聚鸟氨酸(Poly-L-ornithine，PLO)-层黏连蛋白(Laminin)包被好的培养皿；具体步骤如下：将PLO用PBS稀释至15μg/mL，加入到培养皿中至没过培养皿的底部，37℃孵育2h或者4℃过夜，孵育过程中不要让培养皿的底部干掉；弃掉PLO，用PBS润洗两遍，DMEM/F12润洗一遍；将Laminin用DMEM/F12稀释至5μg/mL，加入到PLO包被过的培养皿中至没过培养皿的底部，37℃孵育2h或者4℃过夜，即可。