[发明专利]测定土壤样品DNA提取率的方法

说明书

技术领域

本发明属于土壤生物化学领域，具体涉及一种适用于所有土壤样品DNA提取率测定的方法。

背景技术

土壤微生物(细菌、真菌和古菌等)是土壤生态系统中一类非常重要的生命体。这类微生物种类繁多、数量庞大、功能多样，在土壤有机质的降解、土壤养分的转化与循环、作物的生长与发育、温室气体的排放、污染物的固定和降解等方面起着重要作用。然而，土壤中绝大多数微生物是不可培养的，利用传统的分离培养方法只能得到少数(0.1％-10％)微生物的信息，不能完全反应土壤环境中微生物群落结构的组成、多样性和功能特征。当前，基于土壤微生物DNA的分子生物学技术，如实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)、扩增子测序(16S rRNA和ITS)、宏基因组测序、稳定性同位素核酸探针技术(DNA-SIP)等正在迅猛发展，已经在土壤微生物领域得到广泛应用，很大程度上解决了土壤微生物不可分离培养这样一个瓶颈，在解析土壤微生物丰度、多样性和功能上起着至关重要的作用。

但是，这些分子生物学技术还存在一些问题，前期土壤DNA的提取效果好坏对下游的扩增和测序等步骤影响较大，最终获取的微生物信息(丰度、多样性和功能数据)可能存在一些偏倚。研究表明，土壤DNA的提取方法和土壤样品性质均会影响土壤DNA的提取效果。不同的提取方法(试剂盒、细胞裂解时间和力度不同等)会造成提取DNA的数量和质量有所差异。通常，为了解决这个偏倚，可以通过采用统一的提取方法对所有待测的样品进行统一处理；然而，土壤具有高度异质性，不同类型的土壤样品组分、pH、有机质含量、矿物含量差异很大，对DNA的吸附能力不同，导致DNA的提取效果也存在差异。黏粒土壤对DNA的吸附作用大于沙质土壤，而不同类型的有机质对DNA的吸附能力也大不相同，这些吸附能力与土壤的比表面积、有机官能团和离子交换性能密切相关。土壤对DNA吸附能力的差异决定了土壤DNA的提取效果，进一步影响下游分析的准确度。

通常，土壤样品提取所得的DNA数量可用qPCR的目的基因拷贝数表示(可作为土壤样品微生物丰度的指标之一)。不同土壤样品对DNA吸附性能差异越小，提取所得的DNA数量(提取率)差异也就越小，可比性越强；不同土壤样品对DNA的吸附性能差异越大，说明不同土壤类型对目的基因的吸附能力差异很大，结果可比性就越低；同时，样品提取的DNA数量还会影响扩增子和宏基因组测序的结果，若提取的DNA数量偏少，一些本身数量偏少但是在土壤生态系统中具有重要作用的稀有微生物就不容易被检测出来，导致最终得到的微生物信息存在偏倚。目前，人们只能测定提取之后土壤DNA的浓度，而土壤样品原始的DNA浓度没法测定，因此就无法计算到底有多少DNA在浸提过程中被土壤样品所吸附。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、高效且适用于所有土壤样品DNA提取率测定的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供Aliivibrio fischeri菌株DNA的用途：利用Aliivibriofischeri菌株DNA测定土壤样品的DNA提取率。

本发明还同时提供了一种测定土壤样品DNA提取率的方法，包括如下步骤：

1)、培养Aliivibrio fischeri ATCC 7744T菌株(简称A.fischeri)，提取其DNA，作为测定土壤样品DNA提取率的内标；

2)、设计Aliivibrio fischeri中16S rRNA基因片段的特异性引物(并检验其特异性)；

3)、先在土壤样品中加入内标的DNA，随后立即提取DNA(即，在研磨均质和细胞裂解步骤之前，在土壤样品中加入内标的DNA)；

4)、采用qPCR测定添加到土壤中内标的基因数量和提取之后土壤样品中内标的基因数量，计算DNA提取率。

作为本发明的测定土壤样品DNA提取率的方法的改进：

所述步骤2)中的特异性引物为：

正向引物Af-F:5'-GCGGAAACGACTTAACTGAACC-3'

反向引物Af-R:5'-GAAGGTCCCCCTCTTTGGTC-3'。

作为本发明的测定土壤样品DNA提取率的方法的进一步改进：

内标DNA的添加量为土壤样品总DNA的0.1％-1％。

备注：添加的内标为DNA，非细胞；内标添加的时间在研磨均质和细胞裂解步骤之前。

作为本发明的测定土壤样品DNA提取率的方法的进一步改进，所述步骤4)中：

测定内标基因数的方法为：荧光定量PCR(qPCR)；