[发明专利]表征微生物中抗生素抗性的方法和设备

说明书

本申请是申请日为2010年8月19日、发明名称为“表征微生物中抗生素抗性的方法和设备”的中国发明专利申请No.201080068659.0的分案申请。

技术领域

本发明涉及细菌诊断学领域，特别涉及一种表征微生物的抗生素抗性的方法、实施本发明方法的试剂盒以及用于表征微生物的抗生素抗性的系统，其包括用于实施本发明的方法的质谱分析装置以及样品制备材料。

背景技术

抗生素抗性是微生物抵御抗生素作用的能力。这种抗性通过基因突变和微生物间的质粒交换而发生。抗生素抗性已对医学产生主要影响，而这种影响在未来数年只会增长。

因表现出抗生素抗性而重新获得兴趣的一组机会微生物是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。这些菌种(包括，例如，克雷伯菌(Klebsiella spp)和大肠杆菌(Escherichia coli))包括机会病原体，这些机会病原体已与尿路感染、败血症、呼吸道感染以及腹泻尤其相关。早在三十年前，人们便了解这些菌种对第三代头孢菌素(例如氧亚氨基β-内酰胺)具有抗性，但是从那时才开始记录抗性的指数增长。菌株通过生成分子A类β-内酰胺酶的称为超广谱β-内酰胺酶(ESBL)获得其抗性，所述酶能够灭活第三代头孢菌素(头孢他啶、头孢噻肟、头孢泊肟)和单环内酰胺(氨曲南)。ESBL是常见β-内酰胺酶(例如TEM和SHVβ-内酰胺酶)的衍生物，这种衍生物在酶的活性部位附近进行一次或多次氨基酸置换，从而增加其对第三代头孢菌素和单环内酰胺的亲和力以及水解活性。新一代头孢菌素的广泛使用促使进化出了更多种类的ESBL。ESBL由可转移的接合质粒编码，这些接合质粒负责将抗性传播给其他的革兰氏阴性菌。

根据其物理特性，ESBL被区分为450多种，克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦对ESBL有不同程度的抑制，这一特性可用于在实验室中检测ESBL。目前，在临床微生物学实验室中仅采用表型ESBL检测试验。分子(基因型)试验正处于开发阶段。然而，分子试验存在的问题在于基因型和表型之间缺少100％的相关性。因此，包括ESBL生成细菌在内的任何细菌表型的分子试验的预测值均受到限制。

一般情况下，目前的实验室表型试验较之ESBL基因型确证试验更具有灵敏性和针对性。所有的表型ESBL检测试验依据同样的原理：试验评估在β-内酰胺类抗生素存在时或β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂组合存在时，对细菌生长的抑制作用的变化情况。还有一些从商业渠道获得的各种人工试验和自动化平台，可用于实施这些表型试验。人工试验采用浸有β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂组合的圆盘或试片。浸透的材料放置在固体培养基中，培养基事先接种了已知密度的细菌悬浮液。之后进行过夜培养，通过观察确定生长抑制的情况，并根据抑菌圈的直径对生长抑制的情况进行定量分析。自动化系统建立在细菌生长测量的基础之上，测量细菌在不同浓度的β-内酰胺类抗生素存在时或β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂组合存在时的细菌生长情况。在4到18小时之后，获得此类系统的结果。

目前，需要能够更为迅速地诊断ESBL生成细菌的设备和方法。同时，也需要可以用于临床微生物学实验室的ESBL检测试验以便在酶动力学方面表征ESBL，从而可以跟踪进化趋势，并评估和预测抗生素治疗中的有效剂量。一般来说，这些设备广泛地应用于表征微生物的抗生素抗性。

发明概述

本发明现提供用于快速诊断产生抗生素修饰酶的微生物、尤其是(在优选实施方式中)生成ESBL的微生物的设备和方法。本发明还提供了可表征抗生素修饰酶本身的设备和方法。此类表征可提早检测出新型抗性。

第一方面，本发明提供了一种用于表征微生物的抗生素抗性的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供抗微生物化合物或其酶修饰产物、其分子靶标或者其修饰酶底物化合物的参考质谱；

b)使微生物、其细胞裂解物或其生长培养基上清液暴露于水成液中的所述抗微生物化合物或所述底物化合物，从而提供被暴露的样品；

c)获取被暴露样品的质谱；

d)比较在c)步骤中获取的质谱和在a)步骤中的参考质谱，以及

e)从所述比较中确定在所述暴露后是否出现所述抗微生物化合物、其修饰产物或所述底物的修饰，或者其分子靶标是否过量生成，并确立在观察到所述修饰时所述微生物对所述抗微生物化合物潜在地存在抗性。