[发明专利]一种白介素6的化学发光检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于体外诊断领域，具体是用化学发光法检测人血清中白介素6的试剂盒及其制备方法。

背景技术

白介素6，全称白细胞介素-6（IL-6），是一种多效应的细胞因子，属于白细胞介素的一种。它是由纤维母细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞以及多种瘤细胞产生。白介素6均可由IL-1、TNF-a, PDGF、病毒感染、双链RNA及c AMP等诱导正常细胞产生。白介素6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。白介素6的主要作用为：促进B细胞增生分化和分泌抗体，对肝细胞、T细胞、神经组织、造血体统也具有广泛效应；具有抗瘤效应，也可直接或间接增强NK细胞及CTL的杀瘤活性。因而，白介素6又有许多同义词，如β₂干扰素、肝细胞刺激因子、杂交瘤细胞生长因子、B细胞分化因子等。

白介素6在人体的防御机制中起重要的作用。同时它在多种疾病的发生中也扮演着重要的角色。检测白介素对于了解病情、判断预后、研究发病机制都有非常重要的意义。

目前，国内开发的白介素6检测试剂盒多采用酶联免疫法。采用酶联免疫法进行检测的缺点是辣根过氧化酶或碱性磷酸标记物易失活，显色底物见光易分解，灵敏度低，对结构类似的化合物具有一定的交叉反应，造成测试结果不准确。本发明采用吖啶酯标记，具有如下优点：①反应不需要催化剂，背景发光低，信噪比高，发光反应干扰因素少；②闪光型发光，光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；③吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，提高系统整体灵敏度；④易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；⑤标记物稳定，不受环境氧化剂的影响，在2-8℃下可保存数月之久。因此吖啶取代物是一类非常有效的化学发光标记物。

发明内容

本发明提供了一种具有较高灵敏度和特异性的白介素6的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种白介素6的化学发光检测试剂盒及制备方法，该试剂盒包括样本稀释液、包被有白介素6单克隆抗体的磁性微粒、标记有化学发光标记物的白介素6单克隆抗体、激发液A、激发液B、白介素6校准品溶液以及清洗液。

所述化学发光标记物为吖啶酯，如：NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。

所述样本稀释液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液，内含1%牛血清白蛋白、0.1%TritonX-100和0.3% Proclin。

所述磁珠的表面修饰基团可以为羧基、氨基、链霉亲和素-生物素或对甲苯磺酰基，磁珠粒径可为1.5～3μm。

所述白介素6单克隆抗体是待检白介素6的特异性单克隆抗体。

所述的吖啶酯与抗体的摩尔比为5～10:1，优选摩尔比为7.4:1。

所述的磁微粒可直接与白介素6抗体偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记白介素6抗体。

所述的白介素6的化学发光检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1）制备样品稀释缓冲液：所述样本稀释液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液，内含1%牛血清白蛋白、0.1%TritonX-100和0.3% Proclin。

2）制备包被有白介素6单克隆抗体的磁性微粒：将羧基化的磁微粒溶液磁分离后去上清，用 MES缓冲液重悬，加入EDC溶液，在垂直旋转仪上活化，将活化后的磁微粒与白介素6抗体放置在垂直旋转仪上偶联，磁分离去上清，洗涤3次，再加入含1%BSA的缓冲液进行封闭，最后将磁微粒悬液置于2-8℃保存。

3）制备吖啶酯标记的白介素6单克隆抗体：取白介素6单克隆抗体10μg，加入含NaCl的磷酸盐缓冲液至体积为60μL，再加入1μL吖啶酯母液，震荡混匀，室温避光反应30min，反应后加入40μL含NaCl和甘氨酸的磷酸盐缓冲液，混匀，室温避光反应30min。反应后将产物移至透析袋，透析液为pH为7.4的20mM PBS缓冲液，2-8℃避光透析，每间隔2h换一次PBS，至少更换3次，最后一次透析过夜，以去除未标记的吖啶酯。将标记物取出，按实际体积加入10%牛血清白蛋白至其终浓度为0.1%，加入等体积甘油，混匀，-20℃避光保存。

4）制备白介素6抗原标准品溶液：用含有1%BSA、0.1%TritonX-100、0.3% Proclin、pH为7.4的磷酸盐缓冲液稀释白介素6纯品至浓度为 0pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、150pg/mL、600pg/mL、1000pg/mL白介素6抗原标准品溶液。