[发明专利]曼氏无针乌贼精子表面蛋白及制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是一种曼氏无针乌贼精子表面蛋白及制备方法和用途。

背景技术

在生物体的有性生殖过程中，精子与卵细胞需要最终融合在一起形成受精卵并逐步发育为新的个体，精子细胞作为一种高度分化的单倍体细胞在结构和功能上与体细胞差异显著，它在参与受精过程中的功能都是由精子发育过程中以及发育成熟后各种相关基因特异性表达的结果，精子细胞在结构和功能上的发育成熟是一个高度有序且相当复杂的过程，多种蛋白、离子等生物因子在该过程中发挥作用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种曼氏无针乌贼精子表面蛋白，运用分子生物学技术手段探测曼氏无针乌贼精子表面蛋白对曼氏无针乌贼精子的产生及受精过程的影响。

本发明的目的之二在于提供一种重现性好，得率高的曼氏无针乌贼精子表面蛋白的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种曼氏无针乌贼精子表面蛋白的用途，将曼氏无针乌贼精子表面蛋白用于曼氏无针乌贼生殖的人工调控和癌症检测及治疗中的用途。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：曼氏无针乌贼精子表面蛋白，cDNA全长1463bp，5’非编码区（UTR）92bp，3'非编码区（UTR）222bp，预测的开放阅读框（ORF）共1149bp，编码382个氨基酸，编码蛋白质相对分子质量（MW）为42.058kDa，等电点（pI）4.66。

曼氏无针乌贼精子表面蛋白的制备方法，包括曼氏无针乌贼精子表面蛋白Sp17基因克隆和组织表达特异性分析。

曼氏无针乌贼精子表面蛋白Sp17基因克隆包括RNA提取：取性成熟雄性曼氏无针乌贼的精巢组织，采用Trizol法提取总RNA液；RNA质量的检验：利用核酸蛋白检测仪测定总RNA液在260nm以及280nm处的吸收波长，260/280值在1.8~2.0之间为合格；cDNA第一链的合成：以检测合格的总RNA液为模板，采用反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成；具体的加样体系以及反应条件如下：

200ml微量离心管中加入以下反应体系：

总RNA2µl

Oligo dt 1µl

DEPC水 3µl

混匀后离心，并置于PCR仪内，设置温度为70℃，反应10min后立即取出，冰浴2min结束；在上述反应体系中继续加入以下试剂：

RNase Inhibitor (40U/l)0.25µl

dNTP Mixture (10mM)0.5µl

M-MLV Rtase(200U/l)0.25µl

5×M-MLV Buffer2.0µl

H₂O（RNase^-） 7.0µl

混匀后离心，于PCR仪内设定反应条件为42℃60min，70℃15min，结束后迅速取出，冰浴15min，保存至-20℃备用，长期保存则放置于-80℃冰箱。

曼氏无针乌贼精子表面蛋白Sp17基因克隆包括核心序列的扩增：以成熟的曼氏无针乌贼雄性个体精巢组织的cDNA为模板，利用引物分别扩增得到不同长度的产物片段，该过程所涉及到的反应体系如下：

2×Es Taq MasterMix (Dye)12.5µl

Primer F 0.5µl

Primer R 0.5µl

cDNA 0.5µl

H₂O11µl

PCR反应条件：95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，反应30个循环；72℃ 7min；12℃ 5min结束；反应完成后的PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，对存在目的条带的PCR产物进行纯化回收；所用引物及其序列为：Sp17-1F：AGCAGATGTTAGCCCTTT；Sp17-1R：CTTCAGTATCTTTGGTGCTT；Sp17-2F：TCTTCTAGAGGGTTTCGC；Sp17-2R：TGCAGGAGCTTTTACTTC；Sp17-3F：ACTAAAACTGCTGAAGAG；Sp17-3R：TGTAGCAGCAGCACTGACCT。