[发明专利]鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物

说明书

本发明提供鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物，序列如SEQ ID NO.1‑2所示，具有很高的特异性和灵敏度。建立的方法能够对鸽群中鸽腺病毒感染进行检测，简化操作程序、节约成本。实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察其溶解曲线峰值（Tm值）即可直接对结果进行判断。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

技术领域

本发明提供鸽腺病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测引物，属于动物传染病学领域。

背景技术

实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。当前，实时荧光定量的在非特异性荧光标记中，荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，分别为：不饱和染料（主要是SYBR GreenⅠ）和饱和染料（主要是EvaGreen）有两种常用的荧光染料。前期研究发现，EvaGreen对实时荧光定量PCR的抑制性远小于 SYBR Green I ，故EvaGreen 既可用于多重 PCR ，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲线分析（HRM），该分析正被越来越多的用于实时荧光定量PCR后的基因分型和异源双链分析。此外，EvaGree稳定性极强，且因其对细胞膜透性较低，而较SYBR GreenⅠ更加安全。

腺病毒病毒颗粒为无囊膜的核衣壳呈二十面体对称结构，其基因组为线性双链DNA。腺病毒的核衣壳有3个主要结构蛋白，分别为六邻体蛋白（Hexon）、纤维蛋白 (Fiber)和五邻体蛋白（Penton）。其中，Hexon蛋白是腺病毒科各属病毒最主要的结构蛋白，含有病毒主要的保护性抗原基因簇，与病毒的致病性密切相关。鸽群感染腺病毒（鸽腺病毒PiAd）最早由Coussement等人于1984年在比利时报道。1995年De Herdt等人发现，鸽群可感染1型和2型腺病毒。2014年Marek 等人（Complete genome sequences of pigeon adenovirus 1and duck adenovirus 2 extend the number of species within the genusAviadenovirus. Virology. 2014, 462-463:107-114.）利用高通量测序技术测定了鸽腺病毒1型（PiAd-1）全基因序列，基因组全长为45480bp，和火鸡腺病毒的基因组结构特征类似。遗传进化分析发现，PiAd-1处于禽腺病毒属（Aviadenovirus）遗传进化分支。2017年，Teske等人（Identification of a novel aviadenovirus, designated pigeonadenovirus 2 in domestic pigeons (Columba livia). Virus Res. 2017, 227:15-22.）报道了不同的鸽腺病毒1型（PiAd-1）和腺病毒2型（PiAd-2）的鸽腺病毒（PiAd-2variant A和PiAd-2 variant B）（由于GenBank数据库中没有PiAd-2基因序列，作者为了论述严谨，将其命名为PiAd-2 variant A和PiAd-2 variant B）。基于Hexon基因的遗传进化分析发现，鸽腺病毒（PiAd-2 variant A和PiAd-2 variant B）均处于禽腺病毒属（Aviadenovirus）遗传进化分支。2017年3月，本研究团队在对1例送检的病死鸽中，利用禽腺病毒的Hexon基因检测到阳性感染（命名为FJ2017株），并利用PCR技术获得其完整的Hexon基因序列（上传GenBank得到其登录号为MF576429）。其核苷酸序列和PiAd-1（GenBank号FN824512）同源性为35.2%、和PiAd-2 variant A（GenBank号KX121164）同源性为34.1%、和PiAd-2 variant B（GenBank号KX164406）（说明，PiAd-2 variant B仅测定682bp的Hexon基因片段序列）同源性为83.9%。上述结果表明，我们获得鸽腺病毒为不同于经典鸽腺病毒（PiAd-1）的鸽腺病毒（novel pigeon adenovirus，N-PiAd）。因此，建立能够对鸽群鸽腺病毒的实时荧光定量PCR检测方法，十分有利于在鸽群中开展鸽腺病毒的分子流行病学调查研究。但是，当前国内外尚未见基于饱和荧光染料Eva Green对鸽腺病毒进行检测实时荧光定量PCR检测方法的引物研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域研究空白。