[发明专利]三个适于蛸属动物qPCR的内参基因及其通用引物

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，尤其是涉及三个适于蛸属动物qPCR的内参基因及其通用引物。

背景技术

合适的内参基因，是实时荧光定量PCR(qRT-PCR)中识别目的基因准确表达模式的关键因素。理想的内参基因应具备以下特征：在所有组织及细胞类型中均有表达，且不受外界条件影响；与目的基因表达水平相似。头足类是最近几年才得以广泛研究的海洋生物物种，其功能基因的研究也如火如荼，但至今头足类荧光定量PCR的内参基因多照搬贝类等其它海洋生物，仍无适于头足类自身特性的内参基因。

发明内容

本发明目的在于提供三个适于蛸属动物qPCR的内参基因，该基因在不同环境和试验条件下均能稳定表达，且不受任何内外因素的影响。

本发明的另一目的在于提供适于蛸属动物qPCR的内参基因在实时荧光定量PCR中的应用，以elongation factor-1 alpha、18s以及ubiquitin，elongation factor-1 alpha为内参基因，能够满足实时荧光定量PCR检测蛸属动物基因转录表达水平的要求，提高了蛸属动物基因表达分析研究的稳定性、可靠性和效率。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：适于蛸属动物qPCR的内参基因在实时荧光定量PCR中的应用，提取蛸属动物总RNA，反转录合成cDNA，对合成的cDNA进行实时荧光定量PCR分析检测；所用的内参基因为elongation factor-1 alpha、18s以及ubiquitin，elongation factor-1 alpha的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，18s的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，ubiquitin的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

作为优选，实时荧光定量PCR分析中，扩增elongation factor-1 alpha基因的上游引物序列为GTAGAGATGCACCACGAGTCACTT(如SEQ ID NO.4所示)，下游引物序列为CATACCCACGACGAAGATCCTT(如SEQ ID NO.5所示)；扩增18s基因的上游引物序列为GCGTTCGCTTCGATGAC(如SEQ ID NO.6所示)，下游引物序列为GCCCTTCCGTCAATTCC(如SEQ ID NO.7所示)；扩增ubiquitin基因的上游引物序列为AGAAGGTTAAGTTGGCGGTTTTG(如SEQ ID NO.8所示)，下游引物序列为CCAGCTCCACATTCCTCGTT(如SEQ ID NO.9所示)。上下游引物长度适当，与模板的序列紧密互补，引物与引物之间难以形成稳定的二聚体和发夹结构，在错配位点的引发效率极低。

作为优选，实时荧光定量PCR扩增体系为：取12.5μL SYBR green PCR master mix、1μL模板cDNA、上下游引物(10μmol/L)各0.5μL混合，加入灭菌水至25μL；扩增条件为：将混合物在95℃预变性10min，然后95℃变性15s，60℃退火1min，72℃延伸20s，进行40个循环，最后72℃延伸1min。其中，所用SYBR green PCR master mix购买于赛默飞世尔科技公司。该条件下，靶序列变性彻底，其不影响聚合酶的活性，引物延伸完全，能够达到有效的扩增量，且非特异性扩增少。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供了三个适于蛸属动物qPCR的内参基因，该基因在不同环境和试验条件下均能稳定表达，且不受任何内外因素的影响；本发明还提供了适于蛸属动物qPCR的内参基因在实时荧光定量PCR中的应用，以elongation factor-1 alpha、18s以及ubiquitin，elongation factor-1 alpha为内参基因，能够满足实时荧光定量PCR检测蛸属动物基因转录表达水平的要求，提高了蛸属动物基因表达分析研究的稳定性和可靠性。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明：

实施例1：适于蛸属动物qPCR的内参基因在实时荧光定量PCR中的应用：

1)按照Omega总RNA提取试剂盒的操作说明提取蛸属动物总RNA，再按照TaKaRa公司的PrimeScript TM RT reagent kit with gDNA Eraser反转录试剂盒的操作说明合成cDNA；