[发明专利]用于微量DNA超低频突变检测的双分子自校验文库制备及杂交捕获的二代测序方法

说明书

本发明公开了用于微量DNA超低频突变检测的双分子自校验文库制备及杂交捕获的二代测序方法。该方法包括如下步骤：血浆游离DNA提取，DNA化学错误修复，自校验双分子识别码发夹型接头制备，血浆游离DNA修复，DNA与接头连接，Pre‑PCR扩增，超量杂交捕获，Post‑PCR扩增，上机测序，数据纠错校正，突变分析与注释。本发明的方法可以高效实现血浆循环游离DNA的低频突变检测。DNA错误修复和双重冗余校验技术使得该方法在检测微量样本时具有超低的假阳性率和高灵敏度，避免了现有血浆循环游离DNA检测方法的缺陷，不仅可以实现癌症突变检测和靶向用药指导，也可实现胎儿遗传和出生缺陷早期筛查。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及分子生物学、高通量测序技术和生物信息学相关的微量DNA(包括：循环游离DNA、循环肿瘤DNA、胎儿游离DNA等)的超低频突变检测的文库构建与靶向富集测序方法。

背景技术

液态活检(Liquid Biopsy)与传统的组织活检相比有着迅速、便捷、损伤性小等众多优点。而在各类液态活检技术中，循环游离DNA(circulating cell-free DNA，ccfDNA)检测因为其独特的优势和高通量测序技术的成熟而得到快速的发展。在人体内，每时每刻都有各种来源的游离DNA片段流入到血循环中，而肿瘤患者的肿瘤、孕妇所怀胎儿排出的游离DNA片段也夹杂在其中。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)是游离于血液循环系统中的肿瘤DNA，是肿瘤细胞死亡后释放出的小片段DNA，主要来源为坏死的肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、以及肿瘤细胞分泌的外排体。胎儿游离DNA(cell-freefetal DNA，cffDNA)是游离于孕妇血液循环系统中的胎儿DNA，主要来源于胎盘滋养层细胞。

检测血浆ctDNA中的肿瘤标志物具有区别于传统组织肿瘤标志物筛查的检测方式，具有无创、随时监控和早期筛查等优势，并且对循环游离DNA的取样检测避免了当前分子诊断需要采集癌组织作为标本来源的困难。然而在循环血中除了肿瘤游离DNA，也存在正常组织游离DNA，且因个体差异，肿瘤发生发展时期，治疗时期等原因，循环DNA的总量不定，且往往较癌组织相应频率低得多，尤其早期阶段的癌症血浆ctDNA的丰度甚至在0.01％水平，因此在血浆ctDNA的临床应用中，如何在极低起始量的情况下实现可靠的低频突变检测成为最紧迫的问题。

检测血浆cffDNA中的遗传标志物具有区别于传统羊水组织遗传标志物筛查的检测方式，有无创、早期筛查等优势。与ctDNA类似，cffDNA在孕早期总量不定。现有的检测手段往往要到孕12周、血浆cffDNA平均含量达到10％以上后才能进行检测，以至于错过了最佳干预时间。因此在血浆cffDNA的临床应用中，如何在极低起始量的情况下实现可靠的低频突变检测也成为最紧迫的问题。

新一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)技术的到来让使用液体活检来分析微量循环游离DNA(包括ctDNA、cffDNA等)成为可能。在常规的高通量测序过程中，低起始量和低频突变检测本身是一组矛盾。实现低频突变检测需要提高测序覆盖度，这就要求足够的文库复杂度，进而要求足够的样本起始量。另一方面高通量测序仪器本身存在0.1％-1％(Illumina HiSeq 0.1％，ABI SOLiD 0.2％，Life Ion Torrent 1％)的固有测序错误。因此高效实现对血浆循环游离DNA(cfDNA，包括ctDNA、cffDNA等)低频突变的精确检测，必须高效率地引入测序错误的校正与纠错机制。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种循环游离DNA超低频变异检测的方法。

本发明提供的循环游离DNA超低频变异检测的方法包括如下步骤：

(b1)将待测循环游离DNA连接接头，得到DNA文库；

所述接头是一茎环结构的DNA分子；