[发明专利]基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的生产方法

权利要求书

1.一种基于细胞结构张力变化的表皮可变色的荧光鱼的生产方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤一：选用荧光蛋白对、细胞骨架蛋白、启动子构建表皮可变色的荧光蛋白的重组转座载体；所述细胞骨架蛋白为β-actin，所述荧光蛋白对为青色荧光蛋白和橙色荧光蛋白，所述启动子为CMV IE真核启动子；所述重组转座载体为CMV IE真核启动子-β-actin-eCFP-7aa-eYFP-β-actin-mini Tol2，其序列结构如SEQ ID NO:1所示；

步骤二：将重组转座载体和Tol2mRNA共同注射入待处理鱼种的单细胞期受精卵中，实现目的基因整合入基因组；

步骤三：筛选并鉴定出能够稳定表达表皮可变色的荧光蛋白的鱼种，以获得在光诱导下细胞结构张力变化引起表皮可变色的荧光鱼。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组转座载体的构建过程如下：

1)将荧光蛋白、细胞骨架蛋白分别进行PCR扩增并酶切；

2)将载体、启动子分别进行酶切；

3)步骤1)和步骤2)酶切片段混匀后进行多段连接形成重组转座载体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三获得表皮可变色的荧光鱼后还需进一步进行筛选得到纯合体F3，具体步骤如下：将步骤三获得的表皮可变色的荧光鱼与野生型鱼进行杂交，产生所述表皮可变色的荧光鱼的杂合体F1，从杂合体F1中筛选出表皮表达可变色荧光蛋白的杂合体F1；

选取单个表皮表达可变色荧光蛋白的杂合体F1与野生型鱼进行杂交产生所述表皮可变色的荧光鱼的杂合体F2，从杂合体F2中筛选出表皮表达可变色荧光蛋白的雌鱼和雄鱼；

将筛选的雌鱼和雄鱼进行交配得到表皮可变色的荧光鱼的纯合体F3，从纯合体F3中筛选出含有表皮可变色荧光蛋白的纯合表皮可变色的荧光鱼。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括如下绝育步骤：通过温度物理绝育处理法、静水压物理绝育处理法、电休克物理绝育处理法、细胞松弛素B化学绝育处理法、秋水仙素化学绝育处理法、聚乙二醇化学绝育处理法、或6-二甲基氨基嘌呤化学绝育处理法对纯合表皮可变色的荧光鱼的单细胞期受精卵进行处理，以获得纯合表皮可变色的荧光鱼的四倍体；

将纯合表皮可变色的荧光鱼的二倍体和纯合表皮可变色的荧光鱼的四倍体进行杂交，以获得纯合表皮可变色的荧光鱼的绝育的三倍体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述温度物理绝育处理法包括：将所述纯合表皮可变色的荧光鱼纯合体的单细胞期受精卵置于42℃的养鱼水中，热激10分钟。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括如下色素基因敲除步骤之一：

在所述步骤一之前，通过基因敲除技术对所述待处理鱼种进行处理，敲除其中的鱼体色素基因；或者在获得所述表皮可变色的荧光鱼之后，通过基因敲除技术对所述表皮可变色的荧光鱼进行处理，敲除其中的鱼体色素基因。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待处理鱼种为斑马鱼，被敲除的所述鱼体色素基因是斑马鱼golden基因；

所述色素基因敲除步骤包括：在所述斑马鱼或所述可变色光诱导荧光观赏鱼的golden基因组外显子区域中，寻找NGG的特征序列，其中紧邻NGG之前20bp序列即为候选的目标序列；

将所述目标序列构建入pT7gRNA载体；

将含有所述目标序列的pT7gRNA载体与Cas9mRNA共同注射入所述斑马鱼的单细胞期受精卵或所述表皮可变色的荧光鱼的单细胞期受精卵中，并将其培养成幼鱼；

根据所述幼鱼的鱼体颜色的深浅筛选出色素基因敲除成功的幼鱼作为之后繁殖的种鱼，以制备出敲除了鱼体色素基因的待处理鱼种或生产出敲除了鱼体色素基因的表皮可变色的荧光鱼。

8.一种重组转座载体，其特征在于，所述重组转座载体为CMV IE真核启动子-β-actin-eCFP-7aa-eYFP-β-actin-mini Tol2，其序列结构如SEQ ID NO:1所示。