[发明专利]新的模拟阿尔茨海默病的人诱导多潜能干细胞系及其用途

说明书

本发明涉及一种制备阿尔茨海默病(AD)的细胞模型的方法，其包括将AD相关基因整合到hiPSC中以诱导hiPSC的β‑分泌酶水平增加和/或Aβ‑42肽增加，同时还涉及由该方法制备的阿尔茨海默病(AD)的细胞模型。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别是为阿尔茨海默病(AD)创建生理学相关 的细胞模型。具体地，本发明涉及通过遗传修饰人诱导多潜能干细胞(hiPSC) 制备AD细胞模型的方法。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是慢性神经退行性疾病，是痴呆症的最常见原因。基 于双胞胎和家庭的研究综述，阿尔茨海默病的基因遗传率范围是从49％到 79％^1-2。大约0.1％的病例是家族性的常染色体(非性别连锁)显性遗传，其在 65岁以前发病³。这种形式的疾病称为早发性家族阿尔茨海默病。大多数常 染色体显性家族性AD可归因于以下三种基因之一的突变：编码淀粉样前体 蛋白(APP)以及早老素1和2的那些基因⁴。APP和早老素基因中的大部分 突变增加称为Aβ42的小蛋白质的产生，Aβ42是老年斑的主要成分⁵。

阿尔茨海默病的大多数病例不表现为常染色体-显性遗传，其称为散发 性AD，其中环境和遗传差异可能是危险因素。最显著的遗传危险因素是载 脂蛋白E的ε4等位基因的遗传(APOE)^6-7。40％至80％的患有AD的人至少 有一种APOEε4等位基因⁷。APOEε4等位基因将疾病的风险在杂合子中提 高三倍，在纯合子中提高15倍³。

TREM2基因突变与高出3至5倍的阿尔茨海默病发生风险相关^8-9。普 通认可的作用机制是当TREM2突变时，大脑中的白细胞不再能够控制β淀 粉样蛋白的存在量。

AD具有两个不同的特征：一个是存在含有淀粉样蛋白β-蛋白(Aβ)的细 胞外噬斑，另一个是细胞内神经原纤维缠结(NFT)。虽然AD的真实病理仍 然不清楚，但数十年研究的积累为淀粉样蛋白级联假说提供了有力的证据。 根据这一假设，导致AD的关键事件似乎是在淀粉样前体蛋白(APP)的加工 过程中形成特定的肽，其中淀粉样蛋白β肽42(Aβ₄₂)是易于聚集形成Aβ₄₂寡聚体和随后形成淀粉样蛋白斑块的粘性肽，这是AD的第一个特征。Aβ₄₂聚集体和淀粉样蛋白斑块的存在可以引发神经元的炎症，并且增加钙激活的 激酶的表达，其反过来诱导tau蛋白的过度磷酸化，tau蛋白稳定神经元中的 细胞骨架微管。tau蛋白的超磷酸化导致神经元中神经原纤维缠结的形成， 即AD的第二个特征，并且随后导致神经元死亡^10-14。

三种酶，α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶参与APP的切割。在正常过程 中，APP首先被α-分泌酶或β-分泌酶切割，而γ-分泌酶将进一步切割的产 物加工成具有不同长度的肽的混合物。如果APP被β-分泌酶切割，则产物 将被γ-分泌酶进一步切割，以产生可溶性的40个氨基酸淀粉样肽(Aβ₄₀)或 42个氨基酸的肽(Aβ₄₂)，所述42个氨基酸的肽聚集在一起形成不溶性聚集 体，因此形成淀粉样斑块。淀粉样蛋白级联假说的有力证据来自家族性AD(FAD)的研究，其显示所有家族性AD患者的APP或早老素(PS)基因都具 有突变。APP基因突变导致异常的APP蛋白，所述异常的APP蛋白优先被 β-分泌酶切割产生更多的Aβ肽；而PS基因突变导致优先产生Aβ₄₂肽，Aβ₄₂肽为淀粉样蛋白斑块的成分。另一个重要的观测结果是，AD患者中β-分泌 酶的表达和酶活性显著升高，特别是在代表90％以上AD群体的散发性AD (SAD)患者中。受淀粉样蛋白沉积影响的脑区域中β-分泌酶蛋白和活性水平 升高并且这种升高一直保持，但是AD中的神经元和突触明显丢失^15-17。