[发明专利]一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学，具体的是一种检测GATA‑3转录因子活性的报告基因载体及其应用。报告基因载体含有GATA‑3和TATA‑box特异性顺式作用元件。本发明所设计的报告基因载体易于制备,表达的荧光素酶为外分泌型，无需细胞裂解液，检测过程操作简单，可有效转染真核动物细胞，包括鱼类和哺乳动物细胞系，重复性好，适用于体外研究GATA‑3转录因子在各种真核细胞中的生物学活性。

技术领域

本发明涉及分子生物学，具体的是一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体及其应用。

背景技术

GATA-3是辅助性T细胞2(Th2)的标志性转录因子，属于六个GATA基因家族(GATA-1到GATA-6)中的一员，拥有保守的DNA绑定功能区，能够绑定染色体GATA位点，所以被称为GATA家族。辅助性T细胞通过表达的细胞因子之间的相互作用产生免疫应答，Th2细胞通常表达IL-4，IL-13和IL-5细胞因子，而这些细胞因子在Th1细胞亚群中不表达。GATA-3基因拥有N端的转录功能区域和两个锌指结构，分别是N-端锌指结构和C-端锌指结构，C-端锌指结构具有DNA结合的功能而N-端锌指结构是稳定这个结合及与其他锌指结构蛋白反应。在整个的GATA蛋白家族GATA-3C-端区域具有较高的保守性，在接近C-端的锌指结构附近有氨基酸序列YxKxHxxxRP,具有GATA-3与DNA的结合功能，包括转录活性的能力，诱导Th2细胞因子的表达，从而促进Th2细胞分化的基因重组。通常在T细胞受体接收到特异性刺激信号后，GATA-3的表达量升高，更多的GATA-3蛋白绑定到细胞因子基因群的调节区域包括IL-4、IL-13和IL-5，加速CD4+细胞向Th2分化。最近研究表明GATA-3不仅仅参与免疫系统中T细胞亚群的分化，而且控制着一些乳腺细胞的存活及记忆的功能，是乳腺癌的一个标志性的应答因子。在哺乳动物的研究中，GATA-3还行使有一些关于毛发，皮肤，脂肪及神经系统的发育功能。此外，GATA-3能够激活自身的基因，从而促进自身的表达，形成一种良性的循环，IL-4可以通过自分泌和旁分泌的方式激活STAT6，从而促进GATA-3的表达。

在免疫系统中,GATA-3在未分化的T细胞表达量很低，通过免疫蛋白印迹(Western-blot)及凝胶迁移实验(EMSA)无法检测到低丰度样本中的GATA-3蛋白。此外，GATA-3已经在多种动物中被鉴定出来，包括哺乳动物、鸟类、鱼类及无脊椎动物。但是GATA-3存在多个剪切体、部分剪切体拥有DNA绑定功能域,但是缺乏转录功能，通过免疫蛋白印迹(Western-blot)及凝胶迁移实验(EMSA)无法反映真正行使转录功能GATA-3。

发明内容

本发明目的在于提供一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体，报告基因载体含有GATA-3和TATA-box特异性顺式作用元件。

所述报告基因载体中含有多个GATA-3特异性顺式作用元件串联组成，每个GATA-3特异性顺式作用元件两端分别加入gc和cct，其中，每个GATA-3特异性顺式作用元件由agataga核苷酸序列组成。

所述报告基因载体中，在荧光素酶表达的启动子区域含有4个GATA-3特异性顺式作用元件串联组成。

所述报告基因载体中在4个GATA-3串联形成的特异性顺式作用元件的3’端接入一个TATA-box元件。

其中，每个GATA-3作用元件为“agataga”，每个agataga两端分别加入gc和cct作为保护核苷酸，TATA-box顺式作用元件可以强化转录活性，使检测的灵敏度提高；同时该载体含有卡那霉素和新霉素抗性的基因，可以用于在细菌和细胞中筛选阳性克隆。

一种检测GATA-3转录因子活性的报告基因载体的应用，所述报告基因载体在检测GATA-3转录因子活性中的应用。