[发明专利]一种快速检测乳中单增李斯特活菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测乳中单增李斯特菌活菌的方法，属于食品安全技术领域。该方法是向受检乳中加入PMA，然后置于暗处孵育，接着卤素灯曝光；加入柠檬酸钠和氢氧化钠，经离心，弃上清，洗涤等一系列操作后，提取DNA；以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；利用琼脂糖凝胶电泳法观察条带的有无对LAMP扩增产物进行鉴定，即完成检测。本发明方法耗时较短，检测灵敏度高，可以显著减少原料乳加工前和成品出厂前待检结果的储藏时间。对液体乳中单增李斯特菌活菌的检出限为6.37×10¹CFU/mL，可广泛应用于快速检测食品中的单增李斯特活菌。

技术领域

本发明涉及一种检测单增李斯特菌活菌的方法，属于食品安全技术领域。

背景技术

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)，简称单增李斯特菌，属李斯特菌属，是重要的食源性致病菌之一，分布广泛，生存环境可塑性大，新生儿、孕妇、40岁以上的成人和免疫功能缺陷者易被感染，食用了被单增李斯特污染的食物后可以引起“李氏杆菌病”，这种病能引起新生儿脑膜炎、败血症等疾患，致死率达30％以上。WHO已将其列为食品中四大致病菌之一，因此，单增李斯特菌的污染防控和检测方法一直是公众和研究者关注的热点之一，是许多国家食品中微生物检测的必检指标之一。

然而传统的培养法检测单增李斯特菌费时费力，免疫学方法容易交叉感染。随着分子技术的不断发展，单增李斯特菌的检测已经进入到核酸水平，环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，简称LAMP)发展迅速，其针对目的基因的六个区域设计4条特异性引物(两条外引物和两条内引物)，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)，在等温条件下，1h内即可实现核酸的高效扩增，LAMP技术具有标志性的特征，是其他技术不能比拟的，它操作简单，快速省时，特异性强，灵敏度高，无需特殊设备，鉴定简便，已广泛用于单增李斯特菌的检测。但是LAMP方法会同时扩增样品中的死菌和活菌的DNA，不能有效区分死菌和活菌，易造成高估实际样品中存在的活菌水平。这就会给食品检测带来威胁，并会限制LMAP技术的发展。

发明内容

本发明是要解决现有的LAMP检测方法不能有效区分死菌和活菌、传统的液体乳中致病菌检测方法存在检测时间长，检测成本高的问题，提供一种PMA-LAMP快速检乳中单增李斯特菌活菌的方法。

本发明快速检测乳中单增李斯特活菌的方法，包括如下步骤：

(1)待检乳样的前处理：向待检乳中加入PMA，然后置于暗处进行预孵育，接着置于650W卤素灯下照射，然后曝光一定时间；本步骤操作均在冰浴上进行；

(2)样品DNA的提取：向步骤(1)处理后的待检乳中加入柠檬酸钠和氢氧化钠，然后于10000r/min离心2min，弃上清，得沉淀；

(3)用质量浓度为0.85％的生理盐水洗涤沉淀，然后于10000r/min离心1min，弃上清，用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取，得到提取物；

(4)以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；

(5)鉴定：取5μL LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1×TAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。若产生LAMP特异性扩增条带，表明该待检乳中含有单增李斯特活菌，若无LAMP特异性扩增条带，表明该待检乳中不含有单增李斯特活菌。

进一步地，步骤(1)是向1mL待检乳中加入终浓度为50μM～200μM的PMA，然后置于暗处放置5min～10min，接着置于距650W卤素灯20cm处照射，曝光5min～9min。

更进一步地，所述的PMA的终浓度为50μM。该条件为有效的最小剂量。