[发明专利]猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗以及其制备方法

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗中抗原成分在灭活前为猪流行性腹泻病毒和猪δ冠状病毒，其中，猪流行性腹泻病毒的含量≥10^7.0TCID₅₀/mL、猪δ冠状病毒的含量≥10^7.0TCID₅₀/mL；

所述猪流行性腹泻病毒微生物保藏号是CGMCC No.12663；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

所述猪δ冠状病毒的微生物保藏号是CGMCC No.13853；保藏时间是2017年06月07日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

所述二联灭活疫苗中含有佐剂，抗原与佐剂的质量比例为1:1；所述佐剂为MontanideISA 206佐剂；

所述二联灭活疫苗是由猪流行性腹泻病毒和猪δ冠状病毒灭活后制备获得，灭活后各个抗原的体积比例为1:1；

所述疫苗的制备过程包括以下步骤：

1) 猪流行性腹泻病毒液制备：将长满致密单层的Vero细胞，按0.2%剂量接种猪流行性腹泻病毒，并加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养；

2) 猪δ冠状病毒液制备：将长满致密单层的ST细胞，按2%剂量接种猪δ冠状病毒，并加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养；

3) 当细胞病变在80％以上时，分别收获病毒，并反复冻融2次后，保存于-20℃以下备用；

4) 对收获的病毒液进行病毒含量和无菌检验，将病毒含量在10^7.0TCID₅₀/mL以上、无菌检验合格的病毒液用于灭活；

5) 两种病毒液分别用BEI灭活，灭活检合格后，按照体积比例为1:1进行混合；

6) 与Montanide ISA 206佐剂按照质量比例为1:1乳化即可制成双相油乳剂联苗。

2.根据权利要求1 所述的二联灭活疫苗，其特征在于，猪流行性腹泻病毒和猪δ冠状病毒的灭活是分别将病毒液按0.01mol/L的比例加入BEI，室温条件下以300r/min磁力搅拌灭活12小时，灭活后按0.7%的体积比加入硫代硫酸钠，继续搅拌30分钟后获得。

3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述疫苗的制备过程包括以下步骤：

1) 猪流行性腹泻病毒液制备：将长满致密单层的Vero细胞，按0.2%剂量接种猪流行性腹泻病毒，并加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养；

2) 猪δ冠状病毒液制备：将长满致密单层的ST细胞，按2%剂量接种猪δ冠状病毒，并加入含有胰酶的维持液，在37℃下培养；

3) 当细胞病变在80％以上时，分别收获病毒，并反复冻融2次后，保存于-20℃以下备用；

4) 对收获的病毒液进行病毒含量和无菌检验，将病毒含量在10^7.0TCID₅₀/mL以上、无菌检验合格的病毒液用于灭活；

5) 两种病毒液分别用BEI灭活，灭活检合格后，按照体积比例为1:1进行混合；

6) 与Montanide ISA 206佐剂按照质量比例为1:1乳化即可制成双相油乳剂联苗。

4.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的维持液为MEM培养基，含有100U/ml青霉素和100μg/ml的链霉素。