[发明专利]采用化学发光法定量检测赭曲霉毒素的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，尤其是涉及一种采用化学发光法定量检测赭曲霉毒素的试剂盒。

背景技术

赭曲霉毒素是由真菌如曲霉菌和青霉菌分泌的有毒代谢物，是400多种具有不同化学结构和毒性作用的真菌毒素的主要组成部分。赭曲霉毒素广泛存在于各种食物中，如谷物及其副产品、可可、咖啡、肉类、乳汁、干果、调味品、酒类等，对人类及动物健康造成了很大的威胁。OTA具有肾毒性，免疫毒性和致畸作用，并被国际癌症研究机构（IARC）归类为目前致癌力最强的天然物质之一，并且分布范围很广。最有害的赭曲霉毒素A（OTA）可以在死亡的宿主真菌内存活，并在人体中有长达35天的半衰期。OTA的有害影响与其结构有关，带有7-羧基基团的苯丙氨酸的酰胺键；OTA似乎与天然苯丙氨酸在蛋白质合成中有竞争关系，影响在蛋白质合成和细胞凋亡中酶的抑制和激活，影响免疫抑制、免疫器官的减少和抗体反应抑制，改变免疫细胞活性和调节细胞因子的生成。

OTA作为一种小分子半抗原，不具有免疫原性，因此OTA只能与大分子载体蛋白偶联后才能诱导动物产生免疫应答，再利用单克隆抗体技术获得既能无限增殖又能分泌抗OTA单抗的杂交瘤细胞株，最后通过体内诱生腹水的方法获得大量的抗OTA单克隆抗体。通过筛选反应性最强，灵敏度高和特异性好的抗体配对，建立反应体系，确定适合用于包被的单克隆抗体以及适合用于标记的单克隆抗体。针对包被抗体，建立反应性最高、37℃存放14天后仍能够保持反应性保持稳定的微孔板包被方法及保护蛋白种类，确定OTA单克隆抗体与固相载体能够紧密的连接在一起，使两者经过长时间的高温破坏也能保持稳定。

目前，检测OTA的方法需要有仪器分析和免疫分析。仪器分析包括高效液相色谱（HPLC），液相色谱串联质谱（LC-MS / MS），尽管许多实际样品中具有极高的敏感性和多功能性，但这些检测方法需要样品前期处理的时间长，同时设备昂贵，操作复杂。免疫测定，如酶联免疫吸附测定（ELISA）虽可在较短的时间内完成样品分析，但该方法灵敏度差，检测限偏高，检测结果不精确。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用化学发光法定量检测赭曲霉毒素的试剂盒，以解决现有检测需要的试剂种类多，检测操作繁琐且检测灵敏度低的问题。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的采用化学发光法定量检测赭曲霉毒素的试剂盒，是由空白发光板、包被抗体、酶标抗体、赭曲霉毒素A标准、发光底物、洗涤液组成；所述酶标抗体采用只与OTA特异性结合的单克隆抗体，其亚型为重链IgG1，轻链Kappa型，亲和力达2.11×10¹¹ L/mol。

所述酶标抗体采用的单克隆抗体是将筛选出的阳性单抗用辛酸-硫酸铵法纯化后，通过简易过碘酸钠法偶联得到。

所述包被抗体的制备方法为：将合成的OTA-BSA分别加入弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂用乳化剂乳化，通过背部皮下多点注射的方法，免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠，50μg/只；间隔2周免疫一次，共免疫四次，取效价高的小鼠的脾脏与瘤细胞进行细胞融合，筛选阳性克隆，再通过体内诱生腹水的方法大量制备抗OTA单克隆抗体，最后纯化得到。

所述赭曲霉毒素A标准从OTA的纯品中稀释得到，稀释液为甲醇:水=7:3，共7瓶，其OTA的浓度分别为0ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL、32ng/mL、64ng/mL。

所述发光底物的制备方法为：以0.1mol/l过氧化脲为氧化剂，和缓冲液磷酸氢二钠-柠檬酸配制发光底物A；以0.05mol/l鲁米诺为发光剂，和缓冲液Tris-HCL配制成发光底物B。

本发明采用0.05M pH9.6的CBS缓冲液作为包被缓冲液，5%脱脂奶+0.05M pH7.4的PBST作为封闭液，0.05M pH7.5 Tris-HCL缓冲液作为酶稀缓冲液。

所述洗涤液采用PBS+0.1-0.5%Tween-20。

采用本发明试剂盒检测赭曲霉毒素A时，首先处理标本：

谷物样品处理方法为：将谷物样品粉碎至20目，称取粉末5g至试管中，加入提取液10ml，提取液为甲醇:水体积比=4:1，加塞后再旋涡混匀器上剧烈震荡混匀10min，以5000r/min的速度离心5min，弃去沉淀，保留上清并用PBS将其稀释成适宜的倍数以便进行检测。

血液样品的处理方法：取0.5ml血液加0.5ml的甲醇水溶液，甲醇：水=4:1，备用。