[发明专利]一种肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型、其构建方法及应用

权利要求书

1.一种患者来源的肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型，其特征在于该斑马鱼胚胎移植有患者来源的肿瘤组织的原代单细胞。

2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于所述移植是在受精后24-72小时内进行，进一步优选36-60小时内，更优选在48小时进行。

3.根据权利要求1所述的模型，其特征在于所述移植的部位在胚胎卵黄囊。

4.根据权利要求1所述的模型，其特征在于所述原代单细胞是经过染色试剂染色的，优选的染色试剂选自CM-Dil。

5.根据权利要求1-4所述的模型，其特征在于所述的肿瘤选自胃癌或肺癌。

6.根据权利要求1所述的模型在研究肿瘤的增殖、转移、扩散或耐药的机制，或者筛选有效的肿瘤治疗药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述筛选包括如下步骤：确定肿瘤候选药物胚胎安全范围内的最高药物浓度；以胚胎安全范围内的药物浓度的候选药物处理所述的斑马鱼胚胎，并选用候选药物的溶解溶剂作为对照药物同法处理；在荧光显微镜下对斑马鱼胚胎中患者来源的细胞的增殖、扩散的情况进行定性分析或/和定量分析。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述定量分析按下式公式计算抗肿瘤效果：

药物的肿瘤抑制率＝(药物处理组的荧光强度/对照组的荧光强度)*100％。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于候选药物处理的时间为持续2到5天，优选3天。

10.根据权利要求6-8所述的应用，其特征在于所述的肿瘤选自胃癌，所述药物选自5-氟尿嘧啶。

11.根据权利要求6-8所述的应用，其特征在于所述的肿瘤选自肺癌，所述药物选自吉非替尼、顺铂或多西他赛的一种或二种联用。

12.一种患者来源的肿瘤细胞异种移植斑马鱼模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)将患者来源的肿瘤临床手术组织标本解离成原代单细胞；

(2)将解离所得的原代单细胞染色；

(3)将步骤(2)得到的原代单细胞注射到斑马鱼胚胎卵黄囊内。

13.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于：

步骤(1)所述的解离包括：将样本在生理盐水中进行无菌清洁后，在磷酸盐缓冲液中剪切成小块，经胰酶消化至解离完全，离心，去除胰酶；

步骤(2)所述染色，使用的染料为CM-Dil，染料浓度为1-5μg/ml，染色时间为1-10小时，染色后去除染料，磷酸盐缓冲液洗涤并重悬至细胞密度为5×10³-5×10⁵个/μl；

步骤(3)所述的注射包括：将受精后36-60小时的斑马鱼胚胎固定，采用显微注射器在体视镜下，将10-30nl，优选为20nl的步骤(2)得到的原代单细胞注射入斑马鱼胚胎卵黄囊内。

14.根据权利要求12-13任一项所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(3)后还包括使用荧光显微镜进行定性分析或/和定量分析的步骤。

15.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于在异种移植细胞后的第1-7天内，将斑马鱼胚胎用三卡因麻醉，经荧光显微镜观察荧光细胞在斑马鱼体内的转移和扩散情况。