[发明专利]抗菌融合蛋白及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种抗菌融合蛋白表达载体的构建及其用途。

背景技术

抗生素类药物广泛应用于医疗卫生领域，在治疗感染性疾病挽救患者生命中发挥了重要作用。但是，由于多种因素导致的不合理应用抗生素，耐药菌株逐渐增多，产生多重耐药的现象，导致无法有效控制病原菌的感染，该问题在脓毒症高发的ICU则表现得更甚。目前有研究显示，严重脓毒症患者的血培养结果中，有62％的患者分离出革兰阴性菌，47％的革兰阳性菌。病原微生物组成复杂，且多有耐药性，标准的抗生素治疗无效，进一步加剧了感染性疾病治疗的困境。为有效遏制细菌耐药发展与蔓延，挖掘新药物的需求越来越迫切，也有了一些突破，如具有耐高温、抗菌谱广、杀菌快速且不产生耐药性的抗菌肽等。

抗菌肽(AMPs)是一类广泛存在于自然界生物体内具有广谱抗菌活性的小分子多肽，来源于细菌、真菌、动物、植物等生物体，是机体固有免疫系统抗感染的重要成分，能够有效地抵御外来病原体的入侵。抗菌肽不仅对细菌、真菌、寄生虫和病毒等有着广泛的抑制作用，还对革兰氏阴性菌释放的内毒素具有中和作用，且对正常真核细胞几乎没有毒副作用，这使得抗菌肽在未来医药行业领域有非常好的应用前景。

杀菌/通透性增加蛋白(Bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)是一种存在于人类多形核白细胞颗粒内的55kDa的阳离子蛋白，它是脂多糖结合蛋白(LPS-binding protein，LBP/CD14)的竞争性抑制剂，可以中和内毒素，并且对革兰阴性菌具有细胞毒作用。由BPI的N′端21kDa片段组成的重组蛋白(rBPI21)具有强力、稳定的内毒素中和能力，以及抑制细胞因子表达、中性粒细胞活化和凝血过程等作用，并且在临床试验中显示了良好的治疗效果，rBPI21/rBPI23的一期、二期临床试验结果有明显改善多种临床感染和内毒素血症，显著降低死亡率。尽管rBPI21有很好的临床治疗脓毒症的效果，然而遗憾的是，rBPI21的分子量较小，很容易被肾脏代谢出去，在机体内存在的半衰期短，加上对革兰氏阳性菌没有杀伤作用，使其应用受限。

LL37是人体表达的唯一一种Cathelicidin蛋白，其C′端以两个亮氨酸开始的37个氨基酸，具有广谱抗菌活性。它可以被多种组织和细胞分泌，在肠道、气道、生殖道上皮、眼睛表面和皮肤等组织均有表达，在细胞方面已证实DC细胞、单核/巨噬细胞、淋巴细胞和间充质干细胞等均有表达。目前的研究发现LL-37具有抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、抗真菌和抗病毒作用，另外还具有趋化性和免疫调节能力，以及中和内毒素和调节细胞凋亡的作用。LL37拥有广谱高效的抗病原菌功能，具有广泛应用于临床的巨大潜力。

抗菌肽大多情况下单独存在可发挥其抗菌功能，但对不同菌株的杀灭作用仍存在一定的局限性，且抗菌谱也有待扩大。因此，抗菌融合蛋白已经成为抗感染治疗的一个理想药物。rBPI21和LL37作为人源抗菌蛋白，其具有的良好抗菌活性和内毒素中和作用，若通过生物技术构建rBPI21/LL37融合蛋白表达载体，获得具有更广谱抗菌能力的新型抗菌融合蛋白，将为抗菌药物提供新的选择。

发明内容

针对现有抗菌肽抗菌谱窄、抗菌效果不好，同时杀菌/通透性增加蛋白分子量小，容易被代谢出体内，杀菌效果均不理想的现状，本发明通过生物基因工程技术，构建了一种含有人Cathelicidin抗菌肽基因与人杀菌/通透性增强蛋白BPI活性片段基因的重组载体，转化宿主细胞后，获得具有更高效、广谱的重组抗菌融合蛋白。

本发明解决的第一个技术问题是提供了一种抗菌融合蛋白表达单元，包括：编码BPI来源的抗菌蛋白片段rBPI21和抗菌肽LL-37连接的融合蛋白基因的表达框。

其中，上述抗菌融合蛋白表达单元，是从5'端向3'端依次由编码BPI来源的抗菌蛋白片段rBPI21和抗菌肽LL-37连接的融合蛋白rBPI21-LL37基因的表达框和/或从5'端向3'端依次由编码抗菌肽LL-37和BPI来源的抗菌蛋白片段rBPI21连接的融合蛋白LL37-BPI21基因的表达框。

其中，上述抗菌融合蛋白表达单元，在5'端连接有启动子，所述启动子为CMV启动子。

其中，上述抗菌融合蛋白表达单元，在3'端连接有终止子。

其中，上述抗菌融合蛋白表达单元，所述的融合蛋白rBPI21-LL37表达框组成为：5’到3’方向依次为启动子、rBPI21蛋白信号肽的编码序列、编码rBPI21蛋白的基因、连接肽的基因、抗菌肽LL-37的基因。