[发明专利]利用植物棉子糖合成通路提高种子活力及耐贮性的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用调控植物棉子糖合成通路提高种子活力及耐贮性的应用，具体地说，涉及通过双过表达GOLS与RS基因提高种子活力及耐贮性的研究。

背景技术

棉子糖系列寡糖(Raffinose family oligosaccharides，RFOs)是植物中特有的一类半乳糖苷系列寡糖，国内外研究表明其在抵抗非生物逆境胁迫、种子脱水耐性及其活力形成过程中可能发挥重要功能。RFOs合成通路第一步限速酶肌醇半乳糖苷酶(Galactinol synthase，GOLS)与种子活力形成密切相关。在拟南芥中过表达鹰嘴豆CaGOLS基因能够提高种子耐贮性。关于RFOs第二步关键酶棉子糖合成酶(Raffinose synthase，RS)调控种子活力目前未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供利用调控植物棉子糖合成通路提高种子活力及耐贮性的应用，通过PCR方法克隆了玉米GRMZM2G150906基因(命名为ZmRS)。将该基因与玉米肌醇半乳糖苷合成酶基因ZmGOLS2(GRMZM5G872256)在拟南芥中进行共表达，提高了拟南芥种子中RFOs的总含量，增强了种子活力及耐贮性，且其表现远优于单表达ZmGOLS2株系。本发明主要内容为：在植物中共表达棉子糖合成通路基因GOLS2(肌醇半乳糖苷合成酶)与RS(棉子糖合成酶)基因，提高种子活力及其耐贮性(延长其贮藏寿命)。

其具体技术方案为：

通过在植物中同时过表达Galactinol synthase(GOLS)、Raffinose synthase(RS)基因在提高植物种子活力过程中的应用。

通过在植物中表达Galactinol synthase(GOLS)、Raffinose synthase(RS)基因在调控种子中棉子糖系列寡糖含量及分配过程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明克隆了玉米棉子糖合成关键酶基因ZmGOLS2(肌醇半乳糖苷合成酶/GRMZM5G872256)、ZmRS(棉子糖合成酶/GRMZM2G150906)，通过构建真核表达载体，利用农杆菌转化法分别获得ZmGOLS2、ZmRS单过表达及ZmGOLS2/ZmRS双过表达转化株系，调控了拟南芥种子中棉子糖系列寡糖(RFOs)的含量及分配，增强了种子活力及其耐贮性。ZmGOLS2单过表达可使拟南芥种子耐贮性提高43％。ZmGOLS2/ZmRS双过表达较ZmGOLS2单过表达相比效果更为优异，可使拟南芥种子耐贮性提高102％。

附图说明

图1pCsGFPBT载体示意图。

图2pBI111L载体示意图。

图3ZmGOLS2、ZmRS单表达及ZmGOLS2/ZmRS双表达拟南芥的分子及种子寡糖组分鉴定。(a)拟南芥转化载体构建示意图。(b)转基因拟南芥分子鉴定。上半部分为RT-PCR检测，鉴定转基因植株目标基因的mRNA表达水平；下半部分为Western blot检测，鉴定转基因植株中ZmRS蛋白表达水平。(c-h)各转基因拟南芥株系种子可溶性糖组分鉴定。(c)蔗糖；(d)肌醇；(e)肌醇半乳糖；(f)棉子糖；(g)水苏糖；(h)毛蕊花糖。图中不同字母表示不同株系之间存在显著差异(Duncan test)。

图4ZmGOLS2、ZmRS单表达及ZmGOLS2/ZmRS双表达拟南芥的种子活力鉴定。收获后经脱水的拟南芥种子在饱和KCl(RH 83％)，42℃条件下人工老化3天，经室温晾晒1天后进行种子活力及耐贮性评测。(a)经人工老化处理或未经处理的拟南芥各株系种子TTC染色情况，着色(红色)越深代表种子活力越高。(b)经人工老化处理或未经处理的拟南芥各株系种子吸胀萌发后120小时表型图。(c)经人工老化处理或未经处理的拟南芥各株系种子萌发(％)速率。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1、通过PCR方法克隆了玉米ZmRS基因的编码区，构建了该基因植物表达载体。

对水培的三叶期玉米幼苗进行脱水处理。从脱水处理2小时的叶片提取RNA并将其反转录成cDNA。