[发明专利]一种基于4个基因的结直肠癌早期筛查引物组及试剂盒

说明书

本发明提供了一种基于4个基因的结直肠癌早期筛查引物组，具体由以下引物组成：1）扩增覆盖检测APC基因全外显子序列突变位点的58对正、反向引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：001‑116所示；2）扩增覆盖检测CTNNB1基因全外显子序列突变位点的20对正、反向引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：117‑156所示；3）扩增覆盖检测B‑raf基因全外显子序列突变位点的27对正、反向引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：157‑210所示；4）扩增覆盖检测K‑ras基因全外显子序列突变位点的7对正、反向引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：211‑224所示。本发明可以完整扩增四个基因全外显子，覆盖待检测的所有突变位点，保证了筛查检测的准确性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于4个基因的结直肠癌早期筛查的引物组及试剂盒。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是起源于结直肠黏膜上皮的恶性肿瘤，是临床最常见的恶性肿瘤之一。我国每年结直肠癌新发病例超过25万，死亡病例约14万，新发和死亡病例均占全世界同期结直肠癌病例的20％。然而目前我国结直肠癌的早期诊断率却非常低，相对于欧美国家来说，我国仍需大力普及结直肠癌早期筛查，提高我国结直肠癌早期诊断率、降低结直肠癌相关死亡率。

散发性结肠腺瘤被公认为癌前病变，恶变风险与息肉的大小、绒毛形态和外观等相关。因而，针对一般人群进行结直肠息肉和癌症常规筛查是可靠的措施，过去主要应用大便潜血试验检测，目前配合使用乙状结肠镜和结肠镜检查进行直观检查。这些检查手段都可以降低癌症的发病率和死亡率。然而，这些检测手段都存在着明显的不足，例如作为金标准的肠镜检查，其检出率虽高但不易为患者所接受，并且其检测要求严格，容易受到各种因素的影响；而潜血试验可以避免肠镜检查的有创伤害，容易被患者接受，但其假阳性检出率高，容易造成结果误诊，因而需要寻求更高效简便并且容易被患者所接受的检测方法。

众多研究发现，结直肠癌的发生发展与基因突变密切关联，多基因突变位点已证实与结直肠癌的高度相关性，例如APC、K-ras基因等。通过检测这些基因的热点突变，可以预测结直肠癌的发生发展，也可以筛查出结直肠癌的高危人群。与此同时，粪便游离DNA被发现可用来进行基因检测，尤其是结直肠癌的检测，其结果稳定高效，并且取材方便。相对于传统的结直肠癌筛查方法，基于粪便游离DNA进行的热点突变基因检测，不仅操作简单，减少了各种误差因素，提高了检测稳定性，而且利用粪便作为样本，取材方便，更易于为患者接受。

基于这些，国内已有厂家研究出结直肠癌基因突变测序检测试剂盒，只要检测到任一相应的基因存在一处或以上热点突变，即可诊断该患者为结直肠癌高风险人群。但这些检测试剂盒大多只是针对1或2个热点突变基因位点进行检测，检测序列仅限于基因局部序列，而目前已发现有多个热点突变基因与结直肠癌的发生发展密切关联，因而这些检测极容易造成检测假阴性的比例偏高，影响结果判断。

因此，本发明提供一种更高效全面的筛查检测试剂盒，采用粪便游离DNA作为检测样本，囊括与结直肠癌发生发展高度相关的4个热点突变基因APC、CTNNB1、B-raf和K-ras基因，对4个基因的全外显子序列进行二代测序检测。所涉及的热点突变位点包括覆盖4个基因目前所有的已知的55处热点突变，将测序结果和4个基因的野生型序列比对，只要检测到任一热点突变，即可诊断为结直肠癌高风险患者。

发明内容

本发明提供一种基于4个基因的结直肠癌早期筛查的试剂盒和引物组，具体的为一组联合检测人类APC、CTNNB1、B-raf和K-ras基因全外显子序列突变位点的引物，并采用多重聚合酶链式反应技术结合二代测序进行检测。利用该试剂盒和引物可以准确检测四个基因的所有热点突变的情况，用于结直肠癌早期诊断筛查。