[发明专利]口蹄疫病毒温度敏感减毒株及其构建方法和用途

说明书

本发明公开了口蹄疫病毒温度敏感减毒株及其构建方法和用途。本发明发现，FMDV IRES结构域4的K区环上的一个胞嘧啶突变为鸟嘌呤或腺嘌呤可获得温度敏感减毒株，该突变株具有高度的遗传稳定性，接种猪能够诱导产生高水平的O型FMDV中和抗体、并能够完全抵抗当前优势流行的O型不同基因型FMDV异源毒株的攻击，而且具有良好的安全性。本发明还发现，IRES C351是所有血清型FMDV毒株温度敏感减毒表型的分子决定因素。本发明提供的口蹄疫病毒温度敏感减毒突变株及其全长cDNA感染性克隆、IRES突变体或嵌合IRES序列，可用于制备口蹄疫减毒活疫苗、作为口蹄疫灭活疫苗生产用种毒、或用于制备口蹄疫RNA疫苗。

技术领域

本发明涉及口蹄疫病毒基因组IRES的定点突变体、嵌合体及其在构建口蹄疫病毒温度敏感减毒株中的用途，本发明进一步涉及所构建的口蹄疫病毒温度敏感减毒株在作为FMD防控的减毒疫苗株或用作生产口蹄疫灭活疫苗的安全种毒的用途，属于口蹄疫的防治领域。

背景技术

口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and MouthDisease Virus,FMDV)引起的，主要危害猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病(Grubman and Baxt.2004.Clinical Micro.Rev.17:465-493)，该病一旦爆发会对国际贸易和社会经济造成严重影响，因此在国际上被称为政治经济病，历来受到各国政府的高度重视。

FMDV属于微RNA病毒科、口蹄疫病毒属成员，共有七个血清型(A、O、C、 Asia1、SAT1、SAT2和SAT3)，各血清型毒株之间无免疫交叉保护。该病毒基因组为单股正链RNA，全长约为8.5kb，由5'非编码区(5'UTR)、开放阅读框(ORF) 和3'UTR组成。FMDV的基因组5'末端缺乏帽子结构，其蛋白翻译的起始依赖于5'UTR 中的RNA顺式作用元件—内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site，IRES)，它通过招募真核翻译起始因子及核糖体起始病毒蛋白的合成。FMDV IRES长度约为 450nt，包括4个结构域，它是FMDV蛋白翻译起始的必需元件。

免疫接种是控制FMD流行的重要手段。然而，国内外使用的商业化口蹄疫灭活疫苗存在以下缺点：1)使用强毒株作为疫苗生产种毒，存在灭活不彻底散毒或工厂生产中散毒的风险；2)灭活的FMDV抗原免疫原性差，免疫保护期短，免疫动物在再次感染FMDV时易于形成持续性感染，持续感染动物可能成为再次流行的传染源，这会严重影响口蹄疫免疫清除计划的实施效果；3)口蹄疫病毒抗原易发生变异，疫苗生产种毒的更新赶不上病毒变异速度，这会对灭活疫苗的免疫效果产生较大的影响。人类和动物疫苗的研究历史表明，只有弱毒疫苗才能诱导快速、坚强、持久的免疫应答，可完全克服灭活疫苗存在的缺点和不足，通过使用弱毒疫苗在世界上已成功消灭了天花和牛瘟、控制了小儿麻痹症等病毒性疾病。虽然口蹄疫在世界许多国家和地区流行并且时而在无疫国家爆发，至今被广泛使用的疫苗仍然是免疫期短且成本高的灭活疫苗，国内外尚未成功研制出安全有效的FMDV减毒活疫苗。

在过去的100年中，研究人员一直试图开发一种减毒活疫苗用于口蹄疫的防控，但由于该病毒毒力致弱表型不稳定、致弱毒株不能诱导有效的保护性免疫应答、减毒株在不同动物种属间的致弱程度不同、存在毒力返强的危险等原因，FMDV弱毒疫苗的研发至今尚未取得成功。近年来，随着分子病毒学技术的发展以及对口蹄疫病毒研究的不断深入，尤其是口蹄疫病毒感染性cDNA克隆的使用，可通过结构功能研究确定病毒毒力的决定因素，随后在口蹄疫病毒基因组中引入特定的改变、在体内外评估其减毒表型，这使得开发具有良好免疫原性、且在所有宿主动物中均成功减毒的口蹄疫病毒减毒活疫苗成为可能。开发一种实用性FMDV减毒活疫苗需要满足以下条件： 1)对所有种属的易感动物均是减毒的，不引起临床症状；2)免疫后诱导坚强的免疫应答，对免疫动物能够提供抗感染保护；3)免疫接种动物不排毒，减毒疫苗株在接种动物与健康动物个体之间不传播，不能返祖。这些要求的指标极具挑战性，但它们是一种口蹄疫减毒活疫苗研究取得成功并且获得应用的前提条件。