[发明专利]一种shRNA-cluster序列及其表达载体和用途

说明书

本发明提供一种shRNA‑cluster序列，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体表达上述所述的shRNA‑cluster序列和CAR分子，本发明还提供了它们的用途。本发明通过miRNA‑cluster来源的序列特异性下调PD‑1，Tim‑3，Lag‑3三个受体的表达或下调PD‑1受体表达。本发明在利用CAR分子改造后的T细胞的同时抑制其表面多个抑制性受体的表达，从而增强其拮抗实体肿瘤微环境的抑制性，进而强有力地介导对肿瘤的杀伤，能更好的用于抗实体肿瘤免疫治疗。

技术领域

本发明涉及一种shRNA-cluster序列及其表达载体和用途。

背景技术

自CAR-T免疫技术在2011年针对CD19抗原的急性淋巴型白血病的临床试验取得成果并在2013年被Science杂志评选为当年十大科技突破之首开始，该技术获得的从科学界到金融界一致的好评。

中国每年诊断的新发肿瘤患者超过300万人，多数肿瘤术后复发的概率超过50％，中位生存期不足5年，当前的传统治疗手段在面对大多数难治、复发的肿瘤时疗效捉襟见肘，研发可特异性浸润并有效拮抗实体肿瘤微环境进而介导对其的有效杀伤的CAR-T细胞具备重要的意义。相对于CAR-T细胞在血液型肿瘤取得的丰硕成果，CAR-T细胞在针对实体肿瘤的I期临床试验个体差异性极大，只有少量成功的案例，解决CAR-T对实体肿瘤的浸润与避免过早衰竭是攻克实体肿瘤细胞免疫疗法的关键。

基于实体肿瘤的免疫疗法的发展，科学家研发了大量可特异性识别实体肿瘤表面抗原的单抗类药物，这些蛋白类药物为针对实体肿瘤的CAR-T免疫细胞疗法的研发提供了保障，例如用于治疗Her-2阳性结肠癌、卵巢癌的单抗类药物Trastuzumab(Herceptin)自2010年即被开发为可特异性识别并杀伤Her-2阳性肿瘤的CAR-T免疫细胞，用于治疗EGFR阳性的多种肿瘤的尼妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗均被开发为相关scFv为膜外域的CAR-T免疫细胞并开展了大量的临床试验。然而，除了少数取得了良好的预后效果，大多数针对实体肿瘤的临床试验结果并不理想，利用CAR-T免疫细胞疗法清除患者体内的实体瘤存在广泛的争议。除淋巴瘤之外，在利用对IL13Rα2抗原特异性CAR-T细胞治疗一位50岁的脑胶质瘤的患者的临床试验中，临床医生在超过220天对患者的肿瘤部位以及颅内共计开展了16次细胞回输后终于观察到肿瘤的消失。多个团队利用当前的CAR-T免疫细胞疗法在清除胰腺癌、前列腺癌等实体肿瘤的临床试验，证实了相关CAR-T细胞的安全性以及对肿瘤细胞有限的杀伤。究其原因，肿瘤微环境的抑制性使得CAR-T细胞无法像可溶性的单抗药物一样抑制并杀伤肿瘤细胞，因此针对实体肿瘤的CAR-T技术的研发的重点应偏向于增强CAR-T细胞对实体肿瘤的浸润能力以及对肿瘤微环境中低氧条件的耐受能力。因此设计能够充分浸润肿瘤微环境，长期维持自我更新同时耐受低氧环境，进一步增强对实体肿瘤的杀伤并在体内持续存在行使免疫监视功能的下一代CAR-T免疫细胞技术是利用免疫细胞疗法攻克各种实体肿瘤的关键。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种shRNA-cluster序列，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体表达上述所述的shRNA-cluster序列和CAR分子，本发明还提供了它们的用途。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案：一种shRNA-cluster序列，所述shRNA-cluster序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:2所示。本发明通过miRNA-cluster来源的序列特异性下调PD-1，Tim-3，Lag-3三个受体的表达或下调PD-1受体表达。