[发明专利]一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA及其应用

说明书

本发明公开了一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA及其应用，该shRNA包括正义链核苷酸和反义链核苷酸，所述正义链核苷酸的序列如SEQ NO.1所示，所述反义链核苷酸的序列如SEQ NO.2所示。本发明通过shRNA技术，在PRKAR1A shRNA干扰的UMR‑106和MC3T3‑E1细胞模型中染氟48h，采用Western Blot检测Cleaved Caspase‑3、Caspase‑8、Bim和PARP的蛋白表达，并通过流式细胞术、TUNREL法检测细胞凋亡，证明了PRKAR1A shRNA在氟诱导的成骨细胞凋亡过程中有着一定作用，该shRNA片段可降低氟致细胞凋亡。

技术领域

本发明属于生物工程基因重组技术领域，尤其涉及一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA及其应用。

背景技术

氟作为机体所必需的一种化学性质活泼的非金属微量元素被广泛的应用于生产、生活中。适量的氟对于龋齿的预防及骨质疏松的治疗有着重要的意义，而长期过量的摄入会引起以氟骨症(skeletal fluorosis)和氟斑牙(dental fluorosis)为主要特征的一种慢性全身性疾病，即地方性氟中毒(endemic fluorosis)。骨作为氟作用的主要靶器官之一，是由成骨细胞和破骨细胞构成。成骨细胞作为骨的重要组成部分，其引起的骨形成与破骨细胞引起的骨吸收两者的平衡是维持骨完整性的关键，当它们之间的关系失去平衡时可导致骨转换加速、骨硬化、骨软化、骨质疏松等病变。氟骨症发生过程中成骨细胞的激活、骨转换的加速、细胞凋亡的激活调控等是目前氟骨症发病机制研究的热点问题，这些表型变化都涉及很多信号分子调控。

Gs/Gi-AC-cAMP-PKA细胞信号通路是目前最完善的细胞信号传递模型，是由G蛋白介导的在细胞内普遍存在的信号转导通路。由激动型G蛋白(stimulating adenylatecyclase G protein，Gs)和抑制性G蛋白(inhibitory adenylate cyclase g protein，Gi)介导激活腺苷酸环化酶(Adenylate Cyclase，AC)，AC将三磷酸腺苷(AdenosineTriphosphate，ATP)去磷酸化为细胞环磷酸腺苷(3’，5’-Cyclic AdenosineMonophosphate，cAMP)，蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)作为cAMP的主要效应物，cAMP通过与PKA的调节亚基PRKAR1A结合，释放催化亚基，从而激活PKA。PKA作为cAMP的主要效应物，影响着细胞增殖、分化、凋亡、坏死和合成分泌物质等功能。无活性的PKA是由两个催化(C)和两个调节(R)亚单位组成的四聚体结构，包括3种催化亚基(Cα，Cβ，Cγ)。其中每种调节亚基又分为两种亚型分别为(R1A、R1B、R2A、R2B)。当G蛋白活化时，将细胞中的ATP转化为cAMP，细胞中cAMP浓度增高时，两个cAMP分子与R调节亚基结合导致催化亚基的解离和活化。通过磷酸化特定的丝氨酸或苏氨酸，完成对细胞生长发育，糖及脂类代谢，细胞周期，凋亡等重要生命活动的调节作用。PRKAR1A作为PKA重要的调节亚基，是四个已知调节亚基中分布最为丰富和普遍的。研究发现PRKAR1A对cAMP具有更高的亲和力，细胞内PKA活性主要由它调节而活化。PRKAR1A发生突变时将会通过影响PKA活性或其它信号通路导致各种病理生理改变。

研究发现在PRKAR1A失活突变的淋巴细胞中，通过活化丝裂原蛋白激酶(MAPK)信号通路，细胞增殖和存活率上升，细胞凋亡率下降。PRKAR1A在17q23-24功能获得突变时，PKA活性下降，患者出现一种罕见形式的骨骼发育不良、身材矮小。而在基因敲除小鼠中也发现有骨病变，进一步研究发现病变多为分化不完全的成骨细胞，提示PRKAR1A参与氟骨症中发病机制的调控。但是目前还没有有效的干扰手段。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能降低氟致细胞凋亡的shRNA及其应用，为降低氟致细胞凋亡并将RNA干扰开发用于治疗″氟中毒″的试剂提供一种新的途径。