[发明专利]一种延缓刺参体壁自溶的方法

权利要求书

1.一种延缓刺参体壁自溶的方法，其特征在于，先确定BAPTA-Na的半致死浓度，再在半致死浓度范围内采用剂量为0.50mM、1.00mM、1.45mM的BAPTA-Na灌入到刺参体腔内，通过采用流式细胞仪与激光共聚焦检测手段检测刺参体腔细胞钙离子浓度，体腔细胞凋亡率，以及监测刺参体壁组织变化；将鳌合剂直接灌入到鲜活刺参体内，经过外界刺激后提取刺参体腔液细胞，检测Ca²⁺浓度，细胞凋亡率并监测刺参体壁组织变化；

实施方法：BAPTA-Na半致死浓度检测：取刺参肛门口近1/3处的体腔液，将9只刺参体腔液等体积混合，用300～600目滤布过滤后，取新鲜体腔液100μL于96孔板中；分别加入的0.00～2.00mM不同梯度的的钙离子鳌合剂BAPTA-Na；每孔加入10μL MTT溶液，室温避光孵育3～5h；每孔加入100μL Formanzan溶解液，室温避光孵育3～5h；使用多功能酶标仪在570nm处测定吸光值；根据细胞存活率计算出IC₅₀为1.47mM，因此在低于1.47mM下选取高中低剂量灌入刺参体腔内；

实验分组：将鲜活刺参随机等分为四组，每组9只刺参；UVA组刺参为经10～20W/m²紫外线照射30～60min；BAPTA-Na处理-UVA组刺参为0.50mM、1.00mM、1.45mMCa²⁺鳌合剂灌入刺参体腔内，再经15W/m²紫外线照射30min室温避光静置3h；

利用激光共聚焦与流式细胞仪检测体腔细胞Ca²⁺荧光强度：(1)吸取500μL不同样品时间点的刺参体腔液于1.5mL的Ep管中，1500～3000r/min离心5～8min，弃去上清液，加入HBSS溶液重悬细胞，调整细胞浓度为1X10⁶～10⁷cells/mL；(2)加入Fluo-3AM钙离子探针至终浓度为3～8μM，轻轻混合均匀；(3)分别使用激光共聚焦与流式细胞仪检测体腔细胞[Ca²⁺]_i的变化情况；(4)激光共聚焦参数设置：在timeseries程序下对细胞XY平面进行扫描，扫描其Ca²⁺的荧光强度，激发光波长488nm，发射光波长525～530nm；(5)流式细胞仪的参数设置：通过细胞散点图调整前向角、侧向角电压，调出细胞碎片分界带，选择FITC通道；

利用流式细胞仪检测细胞凋亡率：(1)吸取500μL样品不同时间点刺参体腔液，1500～3000r/min离心5～8min，弃去上清液；(2)利用1×Binding Buffer制备100μL浓度为1X10⁶～10⁷cells/mL的体腔细胞悬液；(3)分别加入3～8μL FITC Annexin V和3～8μL PI；(4)室温避光孵育10～30min；(5)再加入400μL1×Bingding Buffer，轻轻混合均匀，300～600目滤布过滤于流式上样管中；(6)流式细胞仪上机检测；

刺参体壁组织变化：监测在不同处理方式下刺参体壁组织变化情况。