[发明专利]抗病毒活性物质Tenecin活性肽的研制实验方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业技术领域，尤其涉及一种抗病毒活性物质Tenecin活性肽的研制实验方法。

背景技术

植物病毒病是农业生产的严重威胁，每年造成严重的经济损失。有效的防治植物病毒病一直是世界范围内的难题。长期以来，化学农药一直是防治植物病毒的首选方法。然而由于化学病毒制剂的长期、大量使用，造成严重的“农药公害”，因此，从生物源寻找与开发新型的高活性抗病毒药物，不仅具有很高的理论价值，而且在控制作物病毒病绿色生态农业持续发展中具有重要的实践意义。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种抗病毒活性物质Tenecin活性肽的研制实验方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括实验材料：选择50～60日龄黄粉虫幼虫，放置在长29cm宽21.5cm高7cm塑料盆中，一周投喂一次精料，一天投喂一次青料，在温度26℃、湿度60％恒定环境中饲养；

引物：根据GenBank公布的黄粉虫Tenecin基因序列设计特异引物，

上游引物为：5'-GGGGTACCATGCACGAGATCACGATG-3'，

下游引物：5'-CGGGATCCCTAGACCCTCTTTCCGTT-3'，

并引入KpnI和BamHⅠ酶切位点，扩增片段长度为252bp；

黄粉虫RNA的提取及RT-PCR：

采用苯酚－氯仿法提取黄粉虫总RNA，用SuperRTcDNA第一链合成试剂盒以提取的黄粉虫总RNA为模板进行体外反转录扩增，以合成的cDNA为模板进行PCR反应；PCR在25μL体系中进行，2μLcDNA模板，2.5μL25mMMg²⁺，2.5μLdNTP，2.5μL10×聚合酶缓冲液，0.5μL5U/μLTaq聚合酶，2μL上下游引物；反应程序如下:94℃预变性3min；94℃变性30s，51℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72延伸10min.PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，观察特异性条带的出现，以判断克隆的重组结果；

Tenecin基因原核表达载体的构建：

将RT-PCR产物回收，连接于pET28a(+)载体，转化E.coliDH-5a中，随机挑取克隆进行质粒提取，PCR及KpnI和BamHⅠ双酶切鉴定阳性克隆，PCR反应体系及反应条件同1.3所述；酶切体系20μl按说明书进行；阳性克隆进行测序再次验证；

重组质粒pET28a(+)-Tenecin的转化及诱导表达：

将阳性重组载体pET30a(+)-Tenecin转化到原核表达菌株PBL121中；重组菌体均匀涂布到LB固体培养基上，37℃培养10h；挑取单克隆于LB液体培养基，250r/min、37℃过夜培养，按照1∶100的比例进行扩大培养至D600＝0.5～0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，250r/min、37℃培养约4h，12000r/min、30s离心收集菌体，进行12.5％的SDS-PAGE电泳，并用考马斯亮蓝染液进行染色鉴定靶蛋白是否成功表达；

表达产物的纯化：

将阳性菌株按1％的接种量接种于200mL的LB培养基，含终浓度为50μg/mL的Kan中的大量诱导表达靶蛋白，37℃气浴振荡培养至OD600＝0.6～0.8后，取出1mL未诱导的菌液做为对照，然后加入终浓度为1mmol/LIPTG诱导表达4h；然后用50mL离心管分装菌液，置于高速冷冻离心机下4℃4000rpm离心10min，收集菌体，用20mL预冷的

1×BindingBuffer(0.5mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl,5mmol/Limidazole,pH7.9)重悬菌体；在冰上超声破碎菌体，收集上清；上清液采用AKTApurify10系统纯化回收；15％SDS-PAGE和Westernblotting检测蛋白质纯化效果；

表达蛋白抗病毒活性的检测：

以5～6叶期的TMV枯斑寄主心叶烟为实验对象，用ddH₂O将纯化得到靶蛋白溶液稀释到终浓度为10μg/ml，然后与等体积的TMV病毒液混合，静置0.5h；同体积的ddH2O与TMV病毒液混合实验对照；采用半叶枯斑法检测靶蛋白抗病毒活性。

本发明的有益效果在于：