[发明专利]一种在酸条件下诱导表达的启动子

说明书

本发明公开了一种在酸性条件下诱导表达的启动子，属于微生物分子生物学领域。本发明提供的启动子序列如SEQ ID NO.1所示，来源于产甘油假丝酵母WL2002‑5‑59，其能在产甘油假丝酵母中驱动和/或调节有效连接核酸的表达，该启动子的克隆扩大了微生物酸调控研究的基因资源，也为产甘油假丝酵母发酵生产有机酸以及其他需要在酸性条件下发酵生产的产品提供了有效的方法和新的思路。

技术领域

本发明涉及一种在酸性条件下诱导表达的启动子，特别是一种来源于产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes的启动子，属于生物工程技术领域。

背景技术

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes，CCTCC：M93018)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，在中国专利CN1070235C中公开，公告日2001年8月29日，具有耐高渗，高产量，高转化率，生产强度大等特点，居世界领先地位。它能在25％葡萄糖或5％NaCl的高渗透压培养基上正常生长，在实验室规模发酵中，甘油产量可达12％，即使在工业化规模中，甘油产量也达10％。同时，当产甘油假丝酵母发酵进入细胞生长稳定期以后pH下降至3.0左右，甚至更低，而甘油产量依然维持在较高水平。相对于模式菌株酿酒酵母而言，产甘油假丝酵母具有良好的在低pH条件下生长的特性。

启动子是基因表达调控的顺式元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子在转录水平上的重要作用，不仅决定了基因的表达水平，也决定了基因表达的时空顺序，可以说启动子活性的高低在很大程度上影响着基因表达最终产物的表达水平。

具有不同强度和调节机制的启动子是代谢工程和合成生物学中的重要工具，虽然有许多组成型启动子可用，但是诱导型启动子的数量仍然局限于酿酒酵母中的途径工程。目前对酿酒酵母进行代谢改造，大多利用组成型启动子，如糖酵解途径中的强组成型启动子P_TDH3(也称为P_GPD)，P_PGK1，P_TPI1和P_PDC1启动子已被广泛用于酿酒酵母中的基因表达。虽然组成型启动子方便维持基因表达而无需额外的操作，但它们不适用于含有毒性中间体的代谢途径或在特定时间点表达靶基因。而诱导型或调节型启动子可弥补这些问题，在发酵初期，菌体生长阶段，尽可能不表达外源基因，随着发酵时间延长，中间代谢产物的增加，诱导启动子表达目的基因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的产甘油假丝酵母酸诱导基因及启动子序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

如上所述的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，来源于产甘油假丝酵母甘露糖转运蛋白基因。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子的核苷酸序列SEQ ID NO.1，命名为P_gmt。

在本发明的一种实施方式中，所述酸诱导指的酸性环境是pH2左右。

包含所述启动子的载体，例如表达载体、克隆载体及穿梭载体均在本专利保护范围之内。

本发明提供的载体可应用于酵母表达系统；功能基因的筛选(基因克隆于启动子后)、鉴定及优化、调控基因的表达；功能基因的稳定表达(基因克隆于启动子后)或过表达(采用多个启动子或启动胁迫机制)。上述关于启动子的常规应用均属于该发明保护范畴。

产甘油假丝酵母甘露糖转运蛋白基因启动子表达强度的验证；

甘露糖转运蛋白基因启动子表达强度的重组表达载体(图1)，构建过程如下：

将外源绿色荧光蛋白基因GFP克隆连接到质粒pUR-5.8S rDNA-URA5上，得到载体pUR-5.8S rDNA-gfp-URA5；