[发明专利]人源化基因改造动物模型的制备方法及应用

权利要求书

1.一种用于TIM-3基因人源化的靶向载体，其包含：a）与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自TIM-3基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b）插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c）与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自TIM-3基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；其中，所述的待改变的转换区位于Tim-3基因第2号外显子，所述插入或替换的供体DNA序列包括人TIM-3基因DNA序列的第2号外显子的部分，所述人TIM-3基因DNA序列的第2号外显子的部分如SEQ ID NO：34所示。

2.根据权利要求1所述的靶向载体，其特征在于，a）所述与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自NCBI登录号为NC_000077.6的第46454902-46456260位核苷酸；c）所述与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000077.6的第46456585-46457884位核苷酸。

3.一种用于构建TIM-3基因人源化动物模型或TIM-3基因敲除动物模型的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列靶向非人动物Tim-3基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物TIM-3基因上的靶序列上是唯一的，且按照5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；其中，所述sgRNA在小鼠Tim-3基因的靶位点位于小鼠Tim-3基因的第2号外显子上，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-6任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：7-13任一项所示。

4.根据权利要求3所述的sgRNA序列，其特征在于，所述非人动物为啮齿动物，所述啮齿动物为小鼠。

5.根据权利要求4所述的sgRNA序列，其特征在于，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：3所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：8所示。

6.根据权利要求5所述的sgRNA序列，其特征在于，其识别5’端靶位点的sgRNA序列选自SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17；其识别3’端靶位点的sgRNA序列选自SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21。

7.一种包含权利要求3-6任一所述sgRNA序列的构建体。

8.一种包含权利要求3-6任一所述sgRNA序列的载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Tim-3基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Tim-3基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；

（2）合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；

（3）将步骤（1）获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤（2）所述的pT7-sgRNA载体的双链；

（4）将步骤（3）中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。