[发明专利]一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法。

背景技术

随着社会经济的发展，脂肪组织的生理代谢愈来愈受到人们的重视，其原因包括以下两个方面：1.从人类健康角度来看，肥胖，糖尿病，心脑血管疾病等人类代谢疾病与脂肪组织关系密切；2.从人类的消费角度来看，脂肪在肌肉中的沉积是影响肉品质的重要因素，其与肉的嫩度，肌内脂肪含量成正相关，直接决定着肉的口感与风味。

脂肪的沉积与分解由基因决定，了解脂肪组织的基因表达情况对我们解析脂肪的代谢机制至关重要。而脂肪组织RNA的提取则是进行以上研究最为关键的一步。目前，RNA提取技术已经较为成熟，但是，当组织RNA丰度极低，干扰物质较多时，按照常规步骤操作，往往不能取得理想的结果。而脂肪组织的特殊性就在于其脂类物质丰富（成熟细胞包含一个大的中央脂滴），总RNA量极低（单位体积细胞数少，单位细胞RNA含量也相对较少），这都是脂肪组织总RNA较难提取的原因所在。市场上虽有商业化的试剂盒，但其价格昂贵，针对性不强。因此，针对脂肪组织寻求一种费用低，且高效稳定的总RNA提取方法，显得尤为迫切。

发明内容

本发明的目的是提供一种产量大、纯度高的从牛脂肪组织中提取总RNA的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，包括以下步骤：

步骤1：取牛脂肪组织，在液氮环境中研磨至粉末状，迅速转移至预冷的离心管中；

步骤2：向步骤1的离心管中加入trizol，使用振荡器振荡5～20分钟，然后裂解1小时，得裂解液，离心，去除上层脂肪层与底部不溶物，取中间红色透明裂解液；

步骤3：在步骤2所得中间红色透明裂解液中，缓慢加入氯仿，手动振荡混匀，于冰上静置5～20min，然后离心，取透明上清液；

步骤4：在步骤3所得透明上清液中，缓慢加入预冷的异丙醇，于冰上静置5～20min，然后离心，弃上清液，得底部沉淀；

步骤5：在步骤4所得底部沉淀中，加入体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心，弃上清液，得第一次底部沉淀，再次加入体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心，弃上清液，得第二次底部沉淀；

步骤6：取步骤5所得第二次底部沉淀，使用滤纸吸干离心管内的液体，干燥7～10min，然后加入DEPC处理水溶解。

进一步地，所述研磨时间为7～13min。

进一步地，步骤2中所述裂解1小时过程中振荡离心管。

进一步地，步骤1所述的牛脂肪组织的质量和步骤2所述的trizol的体积比为0.1～0.3:1～1.3。

进一步地，步骤2～步骤5所述的离心的转速均为12000r/min ，离心的时间为10～15min，离心温度为4℃。

进一步地，步骤3所述中间红色透明裂解液与氯仿的体积比为3～4:1，冰上静置时上下颠倒使分层消失。

进一步地，步骤4所述透明上清液与异丙醇的体积比为1:1～1.3。

进一步地，所述滤纸呈圆心角度为5～20°的扇形。

本发明的有益效果为：

本发明提供的一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，提高了脂肪组织提取RNA的产量和纯度，且操作简单，经济实惠；本发明增加了单位体积trizol的牛脂肪组织裂解量，同时延长了裂解时间，其目的是为了充分释放组织中的RNA；裂解后，加入氯仿前进行离心，是为了去除牛脂肪组织中的脂类及细胞碎片，以减少其对后续步骤的影响；加入异丙醇后，将离心机加速度调至最低，可以很好的将RNA沉淀收集在离心管的底部，避免RNA不能沉淀到底部或者直接沉淀至离心管壁上；体积分数为75%的乙醇溶液洗涤两次，可以更为彻底的除去脂肪组织中的水溶性杂质；滤纸呈圆心角度为5～20°的扇形，便于深入离心管中快速吸干液体，加速RNA干燥，以提高RNA的复融效率和纯化效果。

附图说明

图1是本发明一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法实施例1中步骤2裂解离心后的效果图；

图2是本发明一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法实施例1中三组所制备的RNA溶液的琼脂糖电泳图；

图3是本发明一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法实施例1中第一组提取的总RNA为模板反转录得到cDNA进行DGAT2基因检测的琼脂糖电泳图；