[发明专利]羊边界病毒抗体检测ELISA试剂盒有效
申请号: | 201711110931.7 | 申请日: | 2017-11-10 |
公开(公告)号: | CN107894504B | 公开(公告)日: | 2020-06-05 |
发明(设计)人: | 许传田;李继奎;鲁梅;黄庆华;崔宁;杜娟 | 申请(专利权)人: | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 |
主分类号: | G01N33/558 | 分类号: | G01N33/558;G01N33/569 |
代理公司: | 长沙星耀专利事务所(普通合伙) 43205 | 代理人: | 许伯严 |
地址: | 250100 *** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 边界 病毒 抗体 检测 elisa 试剂盒 | ||
1.一种羊边界病病毒重组E0蛋白,其特征在于:所述E0蛋白是由E0序列编码的,且所述E0序列为羊边界病病毒基因组中第951bp-1870bp的碱基,所述E0蛋白系将包含E0主要抗原区的基因片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)得到重组表达载体,将该重组表达载体转化BL21感受态细胞,于37℃培养,待OD600值达到0.5-0.6时,加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达,经亲和柱纯化获得;
所述羊边界病病毒重组E0蛋白的制备方法,包括如下步骤:
(1)根据边界病病毒基因序列设计引物P1:GCCGAATTCATCGTAAGTAGGCGTGATTGC(SEQ IDNO.1)、P2:CCCAAGCTTGCTACGATCGAAGTTCAGTTT(SEQ ID NO.2),通过RT-PCR方法对BDV的E0基因进行扩增,以EcoR I和HindⅢ同时对BDV基因RT-PCR产物和pET-32a(+)载体进行酶切,把所述的基因片段克隆入原核表达载体中,然后通过酶切和测序鉴定,获得阳性重组质粒;
(2)将步骤(1)所述的经序列测定正确的重组质粒转化BL21感受态细胞,得到重组表达菌株BL21-E0;
(3)培养所述的重组表达菌株BL21-E0,加入IPTG进行诱导表达,经亲和柱纯化获得所述的重组蛋白。
2.一种检测羊边界病毒抗体的间接ELISA试剂盒,其特征是,所述试剂盒包括用权利要求1所述的羊边界病病毒重组E0蛋白作为抗原包被的ELISA板。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、酶结合物工作液、显色液A、显色液B、终止液、阳性对照和阴性对照。
4.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征是,所述ELISA板的制备为:用pH=9.5的0.5mol/L碳酸盐缓冲液作包被液,将重组蛋白稀释为20pg/mL,按100μL/孔加入Elisa反应板中,4℃包被过夜,拍干,用0.5%牛血清白蛋白30℃封闭2h,以含0.1%吐温-20、pH7.4的PBST洗涤,拍干。
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