[发明专利]用于检测水稻ALS基因发生SNP突变的KASP标记引物及其应用

权利要求书

1.一种用于检测水稻ALS基因中Ser627Asn发生SNP突变的KASP标记引物，其特征在于，所检测的目标基因型包括水稻ALS基因中第1880位G和A，该标记引物包括引物1、引物2和通用引物3；

所述引物1包括第一荧光标签序列、最后一个特定碱基1和位于所述碱基1上游可实现PCR反应的若干碱基，所述最后一个特定碱基1为水稻ALS基因中第1880位A；

所述引物2包括第二荧光标签序列、最后一个特定碱基2和位于所述碱基2上游可实现PCR反应的若干碱基，所述最后一个特定碱基2为水稻ALS基因中第1880位G。

2.一种用于检测水稻ALS基因中Val643Met发生SNP突变的KASP标记引物，其特征在于，所检测的目标基因型包括水稻ALS基因中第1927位G和A，该标记引物包括引物4、引物5和通用引物6；

所述引物4包括第一荧光标签序列、最后一个特定碱基3和位于所述碱基3上游可实现PCR反应的若干碱基，所述最后一个特定碱基3为水稻ALS基因中第1927位A；

所述引物5包括第二荧光标签序列、最后一个特定碱基4和位于所述碱基4上游可实现PCR反应的若干碱基，所述最后一个特定碱基4为水稻ALS基因中第1927位G。

3.一种用于检测水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生SNP突变的KASP标记引物，其特征在于，所检测的目标基因型包括水稻ALS基因中第1880位G和A，以及第1927位G和A，该标记引物包括权利要求1所述的用于检测水稻ALS基因中Ser627Asn发生SNP突变的KASP标记引物和权利要求2所述的用于检测水稻ALS基因中Val643Met发生SNP突变的KASP标记引物。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的KASP标记引物，其特征在于，所述第一荧光标签序列为FAM荧光标签序列，所述FAM荧光标签序列为SEQ ID No：1或SEQ ID No：4所示第1-21位；所述第二荧光标签序列为HEX荧光标签序列，所述HEX荧光标签序列为SEQ ID No：2或SEQ ID No：5所示第1-21位。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的KASP标记引物，其特征在于，所述可实现PCR反应的若干碱基数量不低于10个。

6.一种如权利要求3-5中任一项所述的KASP标记引物在对水稻ALS基因中Ser627Asn和Val643Met同时发生SNP突变时进行鉴定分型中的应用，包括如下步骤：

(1)提取待测水稻的样本DNA作为模板，配制包含有所述KASP标记引物的特异KASP Assay mix；

(2)将由所述步骤(1)提取的DNA模板加入到PCR微孔反应板中，再加入特异KASP Assay mix和通用KASP Master mix，进行PCR扩增；

(3)将所述步骤(2)后得到的PCR扩增产物进行荧光信号扫描，分析，得到PCR扩增产物的散点图和荧光值，统计基因分型情况，若只检测到所述第一荧光信号则表明该样本为纯合双突变ALS基因，若同时检测到第一荧光信号和第二荧光信号则表明该样本为ALS基因突变型与野生型的杂合子，若只检测到第一荧光信号则表明该样本为纯合野生型。

7.一种如权利要求3-5中任一项所述的KASP标记引物在选育抗除草剂水稻品系的应用，其特征在于，包括如下步骤：

a.提取待测水稻的样本DNA作为模板，配制包含有所述KASP标记引物的特异KASP Assay mix；

b.将由所述步骤a提取的DNA模板加入到PCR微孔反应板中，再加入特异KASP Assay mix和通用KASP Master mix，进行PCR扩增；

c.将所述步骤b后得到的PCR扩增产物进行荧光信号扫描，分析，得到PCR扩增产物的散点图和荧光值，统计基因分型情况，若只检测到第一荧光信号则表明该样本为纯合双突变ALS基因，若同时检测到第一荧光信号和第二荧光信号则表明该样本为ALS基因突变型与野生型的杂合子，若只检测到第二荧光信号则表明该样本为纯合野生型；

d.从所述步骤c得到的分型结果中选择含有纯合双突变ALS基因的水稻单株，根据育种的需要进行回交或者自交，得到所述的抗除草剂水稻品系。