[发明专利]用BstEII检测人口腔癌LINC00520基因rs8008130多态性的方法

权利要求书

1.用BstEII检测人口腔癌LINC00520基因rs8008130多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)抽提样品的基因组DNA；

(b)提供扩增人LINC00520基因多态性rs8008130位点附近序列的正向引物和反向引物，以步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；

(c)使用限制性内切酶对(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；

(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC00520基因多态性rs8008130的各基因型。

2.根据权利要求1所述的用BstEII检测人口腔癌LINC00520基因rs8008130多态性的方法，其特征在于，步骤(b)中所述正向引物和反向引物的设计与合成具体为：碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，确定LINC00520多态位点碱基变异数据；

含LINC00520rs8008130的部分基因序列如SEQ:ID:NO:1所示；基因序列的第433个碱基M代表了A/C多态，即为rs8008130的多态性位点；根据rs8008130的具体序列和多态性碱基的位置采用Primer Premier 6.0设计，设置引物长度和扩增目的片段长度进行引物设计，根据GC含量和退火温度选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能进行引物比对，最终确定的上下游引物，正向引物序列如SEQ:ID:NO:2所示；反向引物序列如SEQ:ID:NO:3所示，其中正向引物序列中倒数第5位碱基为G，因此错配后PCR产物中多态附近序列由GTTGACC或GTTGACA更改为GGTGACC或GGTGACA；因此扩增产物中C等位基因片段能被识别G^GTGACC序列的限制性内切酶识别；进而，根据片段切开情况来判断多态基因型；

按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成采用固相合成法或者委托生物公司合成并检测正向和反向引物。

3.根据权利要求1所述的用BstEII检测人口腔癌LINC00520基因rs8008130多态性的方法，其特征在于，步骤(b)中PCR扩增反应中制备PCR扩增体系具体为：2×Taq PCR Mix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μlPCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括35个循环三个步骤，首先94℃变性30s，60.9℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为270bp的PCR扩增产物；扩增后的产物序列为如SEQ:ID:NO:4所示。

4.根据权利要求1所述的用BstEII检测人口腔癌LINC00520基因rs8008130多态性的方法，其特征在于，步骤(c)中进行酶切的酶切体系具体为：PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中60℃酶切3h，即得酶切产物。

5.根据权利要求1所述的用BstEII检测人口腔癌LINC00520基因rs8008130多态性的方法，其特征在于，步骤(d)琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性具体为：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4-10V/cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定；对于不同的基因型，rs8008130位点不同基因型展现出不同的条带，野生基因型CC，长为250bp，20bp两条带；杂合基因型AC，长为270bp，250bp及20bp三条带；杂合基因型AA，270bp一条带。