[发明专利]诱导干细胞成软骨分化的II型胶原水凝胶的制备方法

说明书

本发明公开了一种诱导干细胞成软骨分化的II型胶原水凝胶的制备方法，首先通过II型胶原侧链赖氨酸ε‑氨基与甲基丙烯酸酐的酰胺化反应，合成了具备可光交联性且保持II型胶原三螺旋构象完整性的可光交联II型胶原；再在光引发剂的作用下，引发可光交联II型胶原聚合交联形成具有一定力学强度且可调的单组份II型胶原水凝胶，为干细胞提供生物仿生的分化微环境。

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，涉及用于软骨缺损修复的诱导性水凝胶材料的制备方法及应用。

背景技术

鉴于关节软骨组织无血管且整体代谢速率和活性细胞密度较低等特点，当患者遭受软骨相关方面的疾病或创伤时其自我修复能力十分有限。常见的软骨修复临床手段包括骨髓刺激术、骨软骨移植和假体置换术等，但这些手段通常会引起纤维软骨组织的形成，由于纤维软骨组织结构组成和力学强度与天然透明软骨组织有较大差异，因此常见的软骨修复临床手段难以实现长期有效的治疗效果。而基于组织工程的细胞疗法，通过将软骨细胞或软骨前体细胞接种于生物仿生的相容性支架，有利于对软骨微环境进行重建；其中生物仿生支架对于软骨细胞表型维持和骨髓间充质干细胞(Bone marrow Mesenchymal StemCells,BMSCs)软骨分化至关重要。

II型胶原作为软骨细胞外基质的重要组成成分，具有优异的生物相容性和生物降解性。但II型胶原的纤维组装能力很差，难以形成凝胶，以致不能长期稳定地为细胞提供必要的用于增殖分化的微环境。以II型胶原为原料制备成凝胶的常用交联方式主要是通过戊二醛、京尼平、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)等与冻干的II型胶原海绵共价交联以获得具有一定力学强度的支架材料(C.-S.Ko,J.-P.Huang,C.-W.Huang and I.-M.Chu,Journal of bioscience and bioengineering,2009,107,177-182、X.Zhou,Y.Tao,J.Wang,D.Liu,C.Liang,H.Li and Q.Chen,Journal ofBiomedical Materials Research Part A,2016,104,1687-1693、J.Pieper,P.Van derKraan,T.Hafmans,J.Kamp,P.Buma,J.Van Susante,W.Van Den Berg,J.Veerkamp andT.Van Kuppevelt,Biomaterials,2002,23,3183-3192、或M.G.Haugh,C.M.Murphy,R.C.McKiernan,C.Altenbuchner and F.J.O'Brien,Tissue Engineering Part A,2011,17,1201-1208)。但以上方式制备的支架材料，由于戊二醛、京尼平、EDC/NHS均有毒，使得支架材料存在潜在的细胞毒性；且海绵结构缺乏对三维软骨微环境的仿生，不能为细胞提供适宜的生长和分化环境。此外，复合凝胶材料的使用不足以突出II型胶原对影响和指导细胞行为的重要作用。

发明内容

本发明的目的旨在针对上述现有技术中的不足，提供一种诱导干细胞成软骨分化的II型胶原水凝胶的制备方法，以获得基于II型胶原单一组分的生物相容性水凝胶，构建一个三维的生物仿生微环境能够更好地模拟软骨细胞外基质，从而实现诱导BMSCs成软骨分化。

本发明提供的诱导干细胞成软骨分化的II型胶原水凝胶的制备方法，以从天然软骨中提取的II型胶原作为软骨诱导基质，首先通过II型胶原侧链赖氨酸上的ε-氨基与甲基丙烯酸酐的酰胺化反应，合成具备可光交联性且保持II型胶原三螺旋构象完整性的可光交联II型胶原；再在光引发剂催化作用下，引发可光交联II型胶原聚合交联形成具有一定力学强度且可调的单组份II型胶原水凝胶，具体步骤如下：

(1)配制II型胶原溶液

在常压、0-4℃下，将II型胶原溶解于pH值为1-3的酸溶液中得到质量浓度为1-4mg/mL的II型胶原溶液；