[发明专利]低毒高产杀菌剂吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株及培养方法和应用

权利要求书

1.一种低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株UPAN，其特征在于，采用基因工程方法，将假单胞菌株PA1201基因组中的绿脓菌素的编码基因phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列敲除，并将假单胞菌株PA1201中合成PCN相关基因的启动子替换为启动子PrhlI后获得；

所述合成PCN相关基因包括phz2基因、phzH基因；

将phzH基因的启动子替换为启动子PrhlI时，通过引物分别克隆启动子PrhlI的基因序列、phzH基因的启动子的两端侧翼序列；所述克隆启动子PrhlI的基因序列的引物对如SEQID NO.31和35所示，克隆phzH基因的启动子的两端侧翼序列的引物对如SEQ ID NO.29和30所示、SEQ ID NO.34和36所示。

2.一种如权利要求1所述的低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将假单胞菌株PA1201基因组中的绿脓菌素的编码基因phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列敲除，得三敲除菌株UMS；

B、将三敲除菌株UMS中合成PCN相关基因的启动子替换为启动子PrhlI，即得所述基因工程菌株UPAN；

步骤B中，所述合成PCN相关基因包括phz2基因、phzH基因；

所述启动子的替换方法包括以下步骤：

B1、以三敲除菌株UMS基因组DNA为模板，通过引物分别克隆启动子PrhlI的基因序列、合成PCN相关基因的启动子的两端侧翼序列；

B2、以步骤B1所述的两端侧翼序列和PrhlI的基因序列为模板，通过引物重叠延伸PCR克隆得到置换启动子融合片段；

B3、将融合片段插入到自杀质粒pK18，构建重组自杀质粒；

B4、将重组自杀质粒转化至UMS菌株，筛选得到抗卡那霉素的交换突变株；

B5、将交换突变株置于含有蔗糖的LB培养基上培养，筛选得到置换掉原有启动子的突变株；

B6、通过引物进行菌落PCR，筛选和验证突变体菌株，即得所述基因工程菌株UPAN。

3.根据权利要求2所述的低毒高产吩嗪-1-酰胺的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤A中，所述绿脓菌素的编码基因phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列的敲除方法包括以下步骤：

A1、以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PA1201基因组DNA为模板，通过引物分别克隆基因phzS、phzM或phz1基因簇5’端非编码序列的两端侧翼序列；

A2、以上述两端侧翼序列为模板，通过引物重叠延伸PCR克隆得到融合片段；

A3、将融合片段插入到自杀质粒pK18，构建重组自杀质粒；

A4、将重组自杀质粒转化至PA1201野生型菌株，筛选得到抗卡那霉素的交换突变株；

A5、将交换突变株置于含有蔗糖的LB培养基上培养，筛选得到phzS、phzM以及phz1基因簇5’端非编码序列无痕敲除的突变株；

A6、通过引物进行菌落PCR，筛选和验证突变体菌株，即得所述三敲除菌株UMS。