[发明专利]一种米黑根毛霉来源的β-1,3-葡聚糖酶及其应用

权利要求书

1.β-1,3-葡聚糖酶在食品和饲料行业中水解具有β-1,3键连接的葡聚糖生产聚合度为2-4的β-1,3-葡寡糖中的应用；

所述β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述具有β-1,3键连接的葡聚糖为可得然多糖；

所述β-1,3-葡寡糖为昆布二糖、昆布三糖或/和昆布四糖。

2.根据权利要求1所述的应用，所述β-1,3-葡聚糖酶是通过下述方法制备获得的；

将重组菌进行高密度发酵培养，诱导表达目的蛋白；

所述重组菌是将重组载体导入毕赤酵母得到的重组毕赤酵母；

所述重组载体是将权利要求1中所述β-1,3-葡聚糖酶的编码基因插入毕赤酵母pPIC9K质粒的多克隆位点得到的；

所述发酵培养依次经过如下步骤：

1）种子培养：将所述重组毕赤酵母菌株接种到装有100 mL BMGY培养基的500 mL三角瓶中，在30℃、200 rpm振荡培养24-30 h，得到OD600nm为3.0的种子液；

2）甘油发酵阶段：将步骤1）得到的种子液接种到5 L发酵罐中的2L BMGY培养基中培养，所述培养的温度为30℃、用氨水和磷酸调节pH为5.0、溶氧大于20％，待甘油消耗完全后，进入甘油补料发酵阶段；

3）甘油补料发酵阶段：流加甘油，所述甘油加进所述2 L BMGY培养基的速度为30 mL/h/L起始发酵液，时间为4 h；培养温度为30℃、pH为5.0、溶氧大于20％；待甘油消耗完全后流加甲醇进行诱导；

4）甲醇补料诱导表达阶段：甲醇加进所述2 L BMGY培养基中进行诱导表达培养，培养温度为30℃、pH为6.0、溶氧大于20％；所述甲醇加进所述培养基的速度为 6 mL/ h/L起始发酵液，流加甲醇直至发酵结束；

步骤2）中，所述2L BMGY培养基的溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：质量百分浓度为1％的酵母提取物，质量百分浓度为2％的蛋白胨，100 mmol/L pH 6.0 磷酸缓冲液，质量百分浓度为1.34％的 YNB，质量百分浓度为4×10^-5％生物素和体积百分比为1％的甘油。

3.根据权利要求2所述的应用，所述β-1,3-葡聚糖酶的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤3）中，所述甘油是溶于水中而形成的500 g/L的甘油水溶液。