[发明专利]用于猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR的检测引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属分子生物学领域，具体涉及用于猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR的检测引物及其应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)最早于1974年由德国学者首次分离，是一种无囊膜的单股环状DNA病毒。猪圆环病毒现分为3个基因型，即PCV1、PCV2、PCV3，其中PCV1不能引起猪只发病；PCV2致病性较强，被认为与断奶后仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)、皮炎肾病综合征、繁殖障碍等疾病有关，PCV2在我国及世界各地广泛流行，成为危害养猪业的重要疫病之一；PCV3于今年在我国首次被报道，序列测定显示其基因组序列与PCV1和PCV2同源性较低，关于PCV3的致病性未有进一步研究。

目前PCV2检测常用的方法有：病毒分离培养、间接免疫荧光(IFA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫组织化学法(IHC)、原位分子杂交、常规多重或巢式PCR技术等。前四种方法操作起来费用高且费时费力，并且需要专门的技术人员才能完成，原位分子杂交和常规PCR虽然操作简单、快速，费用少，但不能定量，且常规PCR操作过程中样品之间容易交叉污染，并且产生假阳性。

因此，亟需提供一种可对PCV2不同亚型进行高特异性和灵敏度的核酸含量检测引物及试剂/试剂盒。

发明内容

本发明的目的是克服现有猪圆环病毒2型核酸定量技术上的不足，提供一种用于猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR的检测引物及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种用于猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测的特异性引物，所述特异性引物序列具体如下：

上游引物(P1)：5’-AAGAAGCGGACCCCAACCA-3’，

下游引物(P2)：5’-CGTCCTTCCTCATTACCCTCC-3’；

或

上游引物(P3)：5’-TGGAAGAAGCGGACCCCAACCA-3’，

下游引物(P4)：5’-TCCTTCCTCATTACCCTCCTCG-3’；

或

上游引物(P5)：5’-GAAGCGGACCCCAACCACACAA-3’，

下游引物(P6)：5’-TTCGTCCTTCCTCATTACCCTC-3’；

或

上游引物(P7)：5’-TGGAAGAAGCGGACCCCAA-3’，

下游引物(P8)：5’-CGTCCTTCCTCATTACCCT-3’。

本发明所述引物由上海生物工程技术有限公司合成。

其中，经过四组引物的对比试验，发现了一组在检测灵敏性、特异性及通用性方面表现格外优异的特异性检测引物，因此，优选所述检测引物为上游引物P1和下游引物P2，其扩增片段位于PCV2基因组71～211bp，长度为141bp。

当使用上游引物P1和下游引物P2进行猪圆环病毒2型的实时荧光定量PCR检测，可轻松实现最低检测模板数为10拷贝/μL，并且十分特异，与其他病毒模板无交叉扩增反应，同时对于圆环病毒2型不同基因亚型的毒株均能准确定量。

在此基础上，含有本发明所述检测引物的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。

进一步地，所述试剂或试剂盒可对猪圆环病毒2型实现定量检测。

第二方面，本发明提供一种以非疾病的诊断或治疗为目的的、猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法，具体为：抽提临床样品病毒DNA，与10倍梯度稀释的定量标准质粒(10⁸-10¹拷贝/μL)一起作为模板，利用本发明所提供的检测引物按照以下PCR体系和PCR反应程序进行扩增，获得标准曲线，以待测样品的Ct值代入公式，对样品核酸进行定量。

所述PCR反应体系总体积为20μL：

所述PCR反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火34s，进行40个循环。

进一步地，所述定量标准质粒的制备方法如下：

(1)特异性引物的设计和合成：

设计并(由上海生物工程技术有限公司)合成了一对用于重组标准质粒构建的引物。所述重组标准质粒构建用引物序列如下：

上游引物(T1):5’-AATGGAAGAAGCGGACCCCAAC-3’，