[发明专利]利用PVP制备绵羊性控冷冻精液的方法

权利要求书

1.一种利用PVP制备绵羊性控冷冻精液的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)、10％PVP的配置：

称取0.5g的PVP加入5ml的蒸馏水，室温溶解，配置成10％PVP浓储液，4度保存1月；

(2)、冷冻液Tris-A、Tris-B的配置：

(3)、精液检查：

①外观评定

1)射精量：采精后，将绵羊精液倒入有刻度的离心管中观察即可；

2)云雾运动：用肉眼观察新采的公绵羊精液，可以看到由精子活动所引起的翻腾滚动极似云雾状；精子的密度越大，活力越强者，其云雾状越明显；

3)色泽：绵羊的正常精液呈乳白色或乳黄色；

②活力检测

取适量绵羊精液滴在载玻片上，压片后置于显微镜下镜检，活力≥0.6进行分离；

(4)、绵羊精液的抗生素添加与浓度测定

①绵羊精液经过步骤(3)检查完后，取1ml绵羊精液添加0.3mg林可-奇霉素、0.8mg庆大霉素；

②将添加好抗生素的绵羊精液用50μm精液过滤器过滤至新的离心管中，过滤后使用密度仪检测原精实际浓度；

(5)、添加PVP性控冷冻精液的制备：

①取步骤(4)测完浓度的绵羊精液染色后上机分离，分离后的精子放入4度室平衡90分钟；

②在冷冻液TrisA、TrisB中添加步骤(1)配置的10％PVP，使PVP的终浓度为0.5％，添加完PVP后，将TrisA、TrisB各自混合均匀，放在4℃平衡90分钟；

③将步骤①平衡好的精子离心，去掉上清,按照精子终浓度计算所需总体积的一半加入TrisA与1/2Tris A体积的Tris-B，间隔15分钟后,再加入1/2 Tris A体积的Tris-B，每次添加后颠倒轻轻摇匀；

④装管和冷冻保存：精子摇匀，按每支250μl，500万精子装管，将冷冻精液摆放到冷冻搓板上，然后放入冷冻仪中，按照冷冻仪操作规程进行冻精操作，最后将冻精投入液氮保存。