[发明专利]一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法

权利要求书

1.一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，通过将CHB101基因的编码区转入到玉米基因组中，然后利用Ubi启动子组成型表达CHB101基因，从而提高玉米的抗旱性。

2.如权利要求1所述的一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、总RNA的提取：

S11、取4叶期玉米叶片剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内，加入1ml Trizol，充分混匀，室温放置5-10分钟后，加入RNAiso Plus的1/5体积量的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化，无分相现象后，再室温静置5分钟；12,000g 4℃离心15分钟；

S12、从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中，切忌吸出白色中间层；

S13、向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟后，12,000g 4℃离心10分钟，小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇；

S14、室温干燥沉淀2～5分钟，使酒精完全挥发后，用10-15μl DEPC-H2O溶解RNA，视沉淀量而定；

S2、反转录操作：

S21、用DNaseI处理RNA，10μl反应体系包含：

DNaseI 1μl；

DNaseI buffer 1μl；

RNA 10μg；

DEPC-H2O up to 10μl；

轻轻混匀后瞬时离心，室温放置15min后，加入1μl 25mM的EDTA，65℃处理10min，使DNaseI失活；

S22、在冰上于PCR管中加入以下试剂：

0.5μg/μl的oligo dTnV 1μl；

10mM/each的dNTPs 1μl；

去除DNA的RNA 5μg；

DEPC-H2Oupto 12μl；

轻轻混匀后，65℃处理5min后，迅速转移到冰上冷却2min；

S23、在上述体系中加入：

5×RT buffer 4μl

0.1M DTT 2μl

RNase Inhibitor 1μl

37℃预热2min，加入M-MLV RTase 1μl，37℃温浴50min，70℃处理15min，使酶失活后，反应产物加入40μl 1×TE稀释，充分混匀，保存于-30℃备用；

S3、以反转录产物为模板，通过PCR方法扩增获得玉米CHB101基因，得克隆的CHB101基因；所述克隆的CHB101基因CDS序列全长为2349bp，编码782个氨基酸组成的蛋白，编码的蛋白带有SWIRM和SANT保守结构域，以及一个zinc-binding结构域；

S4、玉米染色质重塑蛋白基因CHB101的过表达载体构建

在通用双元载体pCAMBIA3301基础上改造获得的遗传转化载体；首先将序列表SEQ ID NO：4所示的玉米泛素基因启动子通过SacI和BamHI酶切位点插入pCAMBIA3301中，得到改造遗传转化载体p3301-Ubi；对p3301-Ubi载体用限制性内切酶SalI和NheI进行酶切，去掉CaMV35S启动子和GUS基因；将上述克隆所得的玉米CHB101基因用SalI和NheI消化并回收包含完成CHB101阅读框的DNA片段，在把该片段连入上一步的酶切后p3301-Ubi载体，得到CHB101基因的过表达载体p3301-Ubi-CHB101；

S5、利用PDS-1000台式基因枪进行玉米幼胚转基因操作，具体步骤如下：

1)材料选取：根据授粉时间，取授粉后11天玉米H99种子的幼胚，此时玉米幼胚长约2mm；

2)冲洗玉米穗：加1滴Tween 20，在清水下浸泡、冲洗30min，然后用75％的乙醇泡30min，再用无菌水冲洗三遍；

3)预培养：将经过2)处理后的幼胚，胚轴向下，盾面向上，放在铺有滤纸的含有愈伤组织诱导培养基N6E的培养皿中，30个幼胚/培养皿；缠好封口膜，置于培养箱，28℃，暗培养3天；得到预培养后幼胚；

4)高渗预培养：

将预培养后幼胚转入含有N60SM培养基的培养皿中，28℃，暗培养，进行高渗处理8h，得到高渗预培养后幼胚；

5)载体处理

在高渗处理期间，灭菌Holder和阻挡网，在金粉子弹中加入5μl已等摩尔比预混好的混合载体DNA，混匀，准备好后放在冰上，得到包裹了质粒的金粉悬液；

6)将所得的高渗预培养后幼胚放入基因枪，在载体膜上滴加步骤5)得到的包裹了质粒的金粉悬液，基因枪真空度27～28psi，用650psi和1100psi可裂膜各轰击一次，可裂膜至靶点距离：6cm/9cm；得到轰击后幼胚；

7)将轰击后幼胚在N6SOM培养基上28℃再次高渗预培养20h，采用暗培养，得到轰击后高渗处理幼胚；

8)将轰击后高渗处理幼胚转移至无滤纸的N6E培养基上进行筛选培养，筛选培养条件为28℃暗培养14天，得到筛选培养幼胚；

10)将筛选培养幼胚转移至N6S培养基上传代培养，传代培养条件为28℃暗培养3周/次，共传代3次，得到愈伤组织；

11)将愈伤组织转移到分化诱导培养基RMI上进行分化培养，分化培养的条件为25℃，暗培养3周，得到生长出幼叶的成熟的体细胞胚；

12)将生长出幼叶的成熟的体细胞胚转移至RMII培养基中生根培养，生根培养条件为25℃18h光6h光照培养15天，光照强度为4000lux，即可长出幼苗；

13)待幼苗长到3cm以上，根系完整时，将幼苗从RMII培养基移栽到盛有土的纸杯中，25℃，光培养，每天观察土表面，待彻底干燥后浇水；当纸杯中幼苗长到25cm高时即可移栽到大盆中，撕掉纸杯，将土和苗一移栽倒花盆或者实验田里，得到250株T0代转基因玉米；将空载体pB7RWG采用同样的方法转入野生型玉米中，得到转空载体玉米。