[发明专利]一种分子信标探针检测人类CYP2C9基因多态性的试剂盒、方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种分子信标探针检测人类CYP2C9基因多态性的试剂盒、方法及其应用。

背景技术

CYP2C9是细胞色素P450酶(CYP)第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢酶；CYP2C9能羟化代谢许多不同性质的药物，据统计，目前约有16％的临床药物由CYP2C9负责代谢。CYP2C9参与抗凝血药、抗惊厥药、降糖药、非甾体类解热镇痛抗炎药、抗高血压药以及利尿药等多种药物的羟化代谢，其中华法林、甲苯磺丁脲和苯妥因均为治疗指数较窄的药物。CYP2C9活性变化可导致这些药物体内浓度出现较大变化，甚至导致严重药物不良反应的发生。CYPC2C9*2(rs1799853，C430T，Arg144Cys)和CYP2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)均导致CYP2C9酶活性降低，CYP2C9*3纯合子个体酶活性仅为该位点野生型纯合子基因型个体(携带CYP2C9*1或Arg144/Ile359等位基因)的4～6％。中国人群中CYPC2C9*2的频率为0％，CYPC2C9*3的频率为3％。CYP2C9遗传多态性导致其酶活性变化，从而导致药物代谢种族和个体差异化现象。

华法林是临床上常用的抗凝药物，是深静脉血栓、心房纤颤、心脏瓣膜置换术和肺栓塞等疾病的一线用药，其临床疗效和不良反应存在很大的个体差异，血药浓度过高或敏感性增加可导致严重出血事件。华法林由S-和R-两种消旋体构成，其中S-华法林的抗凝活性约为R-华法林的5倍。85％以上的S-华法林在体内经CYP2C9代谢为无活性的代谢产物，CYP2C9*3纯合子和杂合子基因型个体S-华法林的口服清除率分别下降90％和66％，因此华法林的给药剂量需相应降低。美国FDA已批准修改华法林产品说明书，推荐在使用华法林前进行CYP2C9基因检测。测定CYP2C9*3等位基因可用于指导中国人群确定华法林的起始用药剂量，并预测药物毒性，结合国际标准化比值(International normalized ratio，INR)检测值，估计华法林的维持剂量，确保用药安全。

目前针对多态性位点分析的方法主要有荧光定量PCR(qPCR)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-Restriction Length Polymorphism，PCR-RFLP)、扩增阻滞突变系统-PCR(Amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR)等，但是由于这些方法操作步骤多，费时费力，或者需要PCR后处理，易产生污染，因此不适用于人群大规模的快速检测。测序法是核酸测序的金标准，虽然准确，但是操作步骤繁琐且成本较高。本发明，接触非对称PCR、分子信标技术和溶解曲线分析技术，发明了一种快速、准确的基因分型方法和试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种分子信标探针结合溶解曲线法检测人类CYP2C9基因多态性的试剂盒、方法及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种分子信标探针结合溶解曲线法检测人类CYP2C9基因多态性的引物，包括如下核酸序列：

(1)扩增CYP2C9基因rs1799853多态性位点的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2所示；扩增CYP2C9基因rs1057910多态性位点的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：3和SEQ ID NO.：4所示；

(2)用于检测CYP2C9基因rs1799853多态性位点的探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：5所示，其中探针的5末端标记FAM，3末端标记DABSYL；用于检测CYP2C9基因rs1057910多态性位点的分子信标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：6所示，其中探针的5末端标记HEX，3末端标记DABSYL。

上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。

上述分子信标探针结合溶解曲线法检测人类CYP2C9基因多态性的引物和探针在检测CYP2C9基因多态性中的应用在本发明的保护范围之内。

一种分子信标探针结合溶解曲线法用于检测人类CYP2C9基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括上述引物和探针、2x PCR反应混合液，阳性标准品。

一种分子信标探针结合溶解曲线法用于检测人类CYP2C9基因多态性的方法，包括如下步骤：

(1)提取人外周血基因组DNA；