[发明专利]一种TaqMan‑MGB探针法检测人类TPMT基因多态性的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种TaqMan-MGB探针法检测人类TPMT基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

巯嘌呤类药物如6-巯基嘌呤(mercaptopurine，6-MP)、6-硫鸟嘌呤(thioguanine，6-TG)和硫唑嘌呤(azathioprine，AZP)等是一类具有免疫抑制作用的抗代谢药。6-TG和6-MP常用于恶性肿瘤的化疗，AZP则主要用于自身免疫性疾病及器官移植患者。AZP作为前体药物在肝脏经谷胱甘肽转移酶转化为6-MP。6-MP经次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶代谢为巯基次黄嘌呤单磷酸盐(thioinosine monophosphate，TIMP)，后者再经过一系列的过程代谢为活性代谢产物6-硫鸟嘌呤核苷酸(6-thioguanine nucleotide，6-TGN)后发挥抗肿瘤作用。6-MP也可经TPMT代谢为无活性的6-甲巯基嘌呤(6-methyl MP，6-MMP)。TPMT的活性与红细胞及造血组织中6-MP活性代谢产物6-TNG的水平呈负相关，TPMT活性降低可使巯嘌呤类药物的造血系统毒性(严重的骨髓抑制)增加。

TPMT酶活性分布存在多态性现象，TPMT遗传变异是导致其酶活性降低的主要原因。正常活性的TPMT由TPMT*1等位基因编码，TPMT*2(rs1800462，238G>C，Ala80Pro)、TPMT*3A(rs1800460 460G>A，Ala154Thr；rs1142345，719A>G，Tyr240Cys)、TPMT*3B(rs1800460 460G>A，Ala154Thr)、TPMT*3C(rs1142345，719A>G，Tyr240Cys)是导致TPMT活性下降的主要SNP或单倍型。TPMT基因型可分为3种：野生型纯合子(TPMT*1/*1)、杂合子和突变纯合子。野生型纯合子个体具有正常的TPMT活性，杂合子个体TPMT活性降低，而突变纯合子TPMT酶活性极低甚至缺乏。此外，2种突变等位基因纯合子(TPMT*2/TPMT*3A和TPMT*3A/TPMT*3C)个体也缺乏酶活性。在白种人群和非裔美国人群中，野生型纯合子基因型的频率约90％，突变杂合子基因型的频率约10％，突变纯合子基因型的频率约0.3％。中国人群中TPMT*3杂合子基因型频率约2.2％，未检测到TPMT*2等位基因。TPMT基因多态性与嘌呤类药物的治疗效果和毒副作用密切相关，医生应结合TPMT基因型慎重使用嘌呤类药物。

目前针对多态性位点分析的方法主要有PCR-限制性片段长度多态性(PCR-Restriction Length Polymorphism，PCR-RFLP)、扩增阻滞突变系统-PCR(Amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR)、飞行质谱等，但是由于这些方法操作步骤多，费时费力，或者需要PCR后处理，易产生污染，因此不适用于人群大规模的快速检测。测序法是核酸测序的金标准，虽然准确，但是操作步骤繁琐且成本较高。本发明，采用TaqMan-MGB探针技术，发明了一种快速、准确的基因分型方法和试剂盒，可以为药物的个体化治疗起到积极的推动作用。该技术不仅实现了对核酸特异性扩增的实时监测，而且具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种TaqMan-MGB探针法检测人类TPMT基因多态性的试剂盒及其方法。本发明为药物的个体化治疗起到积极的推动作用。该技术不仅实现了对核酸特异性扩增的实时监测，而且具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种TaqMan-MGB探针法检测人类TPMT基因多态性的引物，包括如下核酸序列：

(1)扩增TPMT基因rs1142345多态性位点的引物对，其核苷酸序列SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2所示；

(2)用于检测TPMT基因rs1142345多态性位点的TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列SEQ ID NO.：3和SEQ ID NO.：4所示，其中SEQ ID NO.：3在5末端标记Fam信号，SEQ ID NO.：4在5末端标记VIC信号；

上述引物对和荧光探针对在一次检测中共同使用。