[发明专利]一种抗VEGF基因、及利用其修饰的T细胞、制备方法和应用

权利要求书

1.一种抗VEGF基因，其特征在于：该基因由导引子、VEGF抗原结合区、CD3抗原结合区、CD8的Hinge区、CD8的跨膜区与共刺激分子依序串联组成；

所述共刺激分子包括4-1BB胞内区和 CD3ζ胞内区的共刺激分子；

导引子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；

VEGF抗原结合区的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；

CD3抗原结合区的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；

CD8Hinge区的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示；

CD8跨膜区的核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示；

4-1BB胞内区的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示；

CD3ζ胞内区的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示。

2.如权利要求1所述的抗VEGF基因，其特征在于：其基因片段为序列表 SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

3.利用如权利要求2所述抗VEGF基因修饰的T细胞，其特征在于：所述T细胞为单核细胞诱导的异质T细胞，且经过携带有所述抗VEGF基因的慢病毒感染得到。

4.根据权利要求3所述的T细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)将导引子、VEGF抗原结合区、CD3抗原结合区、CD8的Hinge区、CD8的跨膜区与共刺激分子合成其整个表达框，插入pLent-C-GFP载体BamHI-NotI位点，转化到E.coli，测序正确后，使用质粒提取试剂盒提取质粒，获得重组表达载体pLent-AntiVEGF-CD3；

2)取外周血，分离外周血单个核细胞；用重组干扰素α2a的培养基诱导培养后，加入重组白细胞介素2、OKT-3和同体血浆诱导继续培养；每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+阳性率 80％，CD3+CD56+双阳性率 20％，视为T细胞诱导成功，并留取该异质T细胞待病毒感染；

3)复苏293T细胞，步骤1)得到的重组表达载体pLent-AntiVEGF-CD3与慢病毒包装质粒采用脂质体转染法转染293T细胞，获得pLent-AntiVEGF-CD3慢病毒；

4)将步骤3)得到的所述pLent-AntiVEGF-CD3慢病毒感染步骤2)制得的异质T细胞，获得抗VEGF基因修饰的T细胞。

5.如权利要求3所述的T细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：在制备治疗肝癌的药物中的应用。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所用T细胞的数量为0.5×10⁶-1×10⁹/kg。