[发明专利]一种检测脊肌萎缩症相关的基因突变的方法

权利要求书

1.一种脊肌萎缩症患者SMN1基因突变的检测方法，所述方法包括如下步骤：

(1)用抑制无义介导的mRNA降解机制的药物或抑制无义介导的mRNA降解机制的干扰RNA处理来源于待测患者的细胞；

(2)提取处理后的目标细胞中的总RNA；

(3)测定SMN1转录本并分析目标突变。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞为来自于脊肌萎缩症患者的淋巴细胞系、皮肤成纤维细胞系或原代培养的细胞。

3.所述的无义介导的mRNA降解机制为UPF1基因调控的无义介导的mRNA降解机制；

所述的药物为放线菌酮或嘌呤霉素；

所述的干扰RNA为shRNA，优选的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SMN1基因突变包括但不限于如下突变：p.Ser8Lysfs*23、p.Glu14*、p.Gln15*、p.Val19Glyfs*21、p.Leu228*、p.Ile249Tyrfs*16、p.Tyr272Trpfs*35、p.Gly279Glufs*5等无义突变或移码突变。

5.根据权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于，

步骤(1)所述的用抑制无义介导的mRNA降解机制的药物处理目标细胞的步骤为：向细胞悬液中加入放线菌酮，或向细胞悬液中加入嘌呤霉素，继续培养；

步骤(1)所述的用抑制无义介导的mRNA降解机制(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)的干扰RNA处理来源于待测患者的细胞为：用表达shRNA的RNAi慢病毒载体转染目标细胞，抑制NMD。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，加入放线菌酮的浓度为20～500μg/ml，优选为50～150μg/ml；加入嘌呤霉素的浓度为20～500μg/ml，优选为100～400μg/ml；培养时间为2～20小时，优选为5～10小时。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的用表达shRNA的RNAi慢病毒载体转染目标细胞的步骤为：

1)制备UPF1基因RNAi慢病毒载体；

2)将其加入至患者皮肤成纤维细胞(终浓度为50MOI)，孵育24小时后更换新鲜培养基并检测转导效率；

优选的，所述的慢病毒载体为表达序列如SEQ ID NO.1所示的shRNA的慢病毒载体pGV248。

8.根据权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于，

步骤(3)所述的测定SMN1转录本并分析目标突变的方法包括但不限于：

1)用Real-time PCR方法对目标突变进行检测；

或2)用一代sanger测序法对目标突变进行检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的用Real-time PCR方法测定SMN1转录本并分析目标突变的步骤为：

1)标准质粒构建：合成正常对照的样品的cDNA第一链：用SMN1引物对扩增SMN1，用GAPDH引物对扩增GAPDH基因；扩增后的产物克隆入pGEM-T载体中，测序验证克隆子中插入的基因序列；

所述SMN1引物对序列为：

SEQ ID No.2、SEQ ID No.3；

2)提取上述2种质粒，测定质粒浓度，根据质粒的碱基数推算质粒的拷贝数，并将标准质稀释成10³～10⁸，制备标准曲线；

3)定量分析：利用SMN1特异性MGB探针和特异性引物对；以GAPDH基因为内参进行扩增，扩增总体积为20μl，其中包含：

2×GoldStar TaqMan Mixture、

20ng的cDNA、

4pmol引物和4pmol的探针，

用7500Real-Time PCR仪进行检测，扩增循环条件为：95℃变性10分钟,95℃15秒，60℃1分钟，40个循环。

所述的SMN1特异性MGB探针的序列为SEQ ID No.4；

所述的SMN1特异性引物对的序列为：SEQ ID No.5、SEQ ID No.6。

10.本发明还涉及一种使用权利要求1-9任一所述的方法制备的检测脊肌萎缩症患者SMN1基因突变的检测试剂盒，其包含：

(1)抑制无义介导的mRNA降解机制的药物或shRNA；

(2)mRNA提取试剂及反转录试剂；

(3)检测目标突变所需的引物、探针和必要的试剂。

所述的抑制无义介导的mRNA降解机制的的药物为放线菌酮或嘌呤霉素；

所述的抑制无义介导的mRNA降解机制的shRNA的序列如SEQ ID NO.1；

所述的SMN1基因突变包括但不限于如下突变：

p.Ser8Lysfs*23、p.Glu14*、p.Gln15*、p.Val19Glyfs*21、p.Leu228*、p.Ile249Tyrfs*16、p.Tyr272Trpfs*35、p.Gly279Glufs*5等无义突变或移码突变。