[发明专利]一种应用斑马鱼评价量微样品抗骨质疏松活性与安全性新方法

权利要求书

1.一种斑马鱼骨质疏松模型、斑马鱼代谢方法及斑马鱼毒性评价一体化应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：斑马鱼受精卵的收集：控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在14-12小时：10-12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基，于26℃-30℃恒温培养箱中培养；步骤二：给药方案：取受精后1-3天斑马鱼胚胎或幼鱼放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基1-2mL，每个孔里放6-10条幼鱼，分为数组，溶媒阴性对照组和测试药物组，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26℃-30℃恒温培养箱中培养，培养周期5-7天，必要时隔天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后6-10天；

步骤三：将培养至受精后8-10天斑马鱼置于100mg/L的MS-222中麻醉致死，去除MS-222溶液，然后将幼鱼固定于4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液中2-3h，将固定液4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液去除，然后将斑马鱼幼鱼置于PBST溶液中洗涤3次，每次10min，然后置于含3％H₂O₂和1％KOH的混合溶液中漂白30min～2h，至斑马鱼眼部色素清除后去除漂白液，再用PBST洗涤幼鱼3次，每次10min，将幼鱼置于茜素红染色液中数小时至过夜，去除染色液后，依次通过3:1、1:1、1:3的1％KOH和甘油的混合溶液透明幼鱼，最后保存于纯甘油中；

步骤四：斑马鱼骨骼染色的检测与分析：用倒置显微镜观察步骤三中茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，用成像软件采集图像，所有的图像均采用相同的光强度和曝光设置；用专业图像分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度，以分别反应骨矿化量和骨密度，计算平均值，标准偏差，并进行t-检验；

步骤五：代谢产物的检测与分析：斑马鱼给药期间为受精后1天到受精后10天，可定时取药液，采用高效液相色谱或联用质谱技术分析代谢产物；

步骤六：斑马鱼安全性评价：斑马鱼给药期间为受精后1天到受精后10天，每天用计算半数致死浓度LC50计数鱼死亡数量，显微镜观察主要脏器毒性。

2.根据权利要求1所述的一种斑马鱼骨质疏松模型、代谢方法与毒性评价一体化联合方法，用于评价受试药物为量微成分、组分或中药提取物的代谢、抗骨质疏松活性与安全性。